一国内细胞培养产能：

目前国内大分子生产产能正在快速提升，随之带来大量的华体会体育最新地址 需求。

部分国内企业产能概括

并且这些企业的产能还在大量的建设，预计未来顶峰时期国内的产能会达到100万升。这将会带来华体会体育最新地址 的大量使用，特别是目前行业越来越青睐于连续流生产，这会消耗更多的华体会体育最新地址 。顶峰时期CHO细胞培养的华体会体育最新地址 消耗预计会达到2000万升左右。

2：基础华体会体育最新地址

在抗体类产品的生产中，无血清华体会体育最新地址 的使用已经成为标准，CD华体会体育最新地址 的使用也越来越多。老一代的商业化工艺仍可能使用血清或水解物，但是新一代的 CHO 华体会体育最新地址 已经不再使用血清及水解物，以避免因血清来源而引起的外源因子污染的风险和水解物带来的批间差异。 有多种市售的华体会体育最新地址 配方可以支持抗体生产上用到的宿主细胞系在无血清条件下的生长和生产，现在行业重点关注的是设计、开发和销售针对当今生物制药行业通常使用的各种 CHO 细胞系的特定华体会体育最新地址 。 因为对于给定的生产细胞系，每一种华体会体育最新地址 很有可能表现不一样，所以一般通过比较几种不同的基础华体会体育最新地址 维持细胞生长和生产产品的能力来筛选基础华体会体育最新地址 。通常一些商业配方的组合可以提供更高的生产效率。整合候选克隆和基础华体会体育最新地址 的筛选可以变得更高效，能够节省大量的工艺开发时间，并且获得更高的生产效率和产量。

2.1：能量源

哺乳动物细胞使用葡萄糖和谷氨酰胺作为优选的能量来源。杂交瘤细胞和生产重组抗体的细胞系的葡萄糖利用率一般在1~10 pmol /细胞*天。在缺少葡萄糖，或者某些可替代的糖，比如果糖的情况下，哺乳动物细胞则不会生长。通过糖酵解过程，葡萄糖被利用产生乳酸，培养前期乳酸会在生物反应器中累积。虽然在细胞培养过程的后期，乳酸可以被细胞利用，但是过量的乳酸积累会抑制细胞的生长和单克隆抗体的生产。乳酸的水平可以通过多种方式被控制，比如营养物质的加入量来控制，甚至可以导致乳酸代谢从净生产向乳酸净消耗的转变。乳酸脱氢酶（LDH）可以催化丙酮酸转化为乳酸。有报道在 LDH 和丙酮酸脱氢酶激酶表达被下调的 CHO 细胞中，乳酸的生成下降 90%，比生产力提高 75%，而单位体积抗体的生产则提高 68%，同是对细胞的生长没有明显的影响（但本人认为此方法可能具有极大的偶然性或个例性）。更好的了解低产和高产细胞系的代谢特征和调控机制，将有助于开发高产的细胞培养工艺。

谷氨酰胺通常与葡萄糖一起被利用，以支持细胞的生长并帮助维持哺乳动物细胞培养中的细胞活力。杂交瘤细胞的谷氨酰胺的利用率1~5 pmol /细胞*天。 CHO 细胞对谷氨酰胺的依赖性要低于杂交瘤或鼠骨髓瘤细胞，因此在华体会体育最新地址 中可以添加较少的谷氨酰胺就可以维持生长。最近对 CHO 细胞的代谢分析，发现谷氨酰胺在呼吸作用中要比葡萄糖更加有效的利用，并且在指数生长期对乳酸的产生贡献更大。谷氨酰胺的代谢会产生氨，氨累积在华体会体育最新地址 中，会抑制细胞的生长和产物的生产，并可以通过抑制糖链末端的唾液酸化来影响单克隆抗体的糖基化。单克隆抗体末端的唾液酸化也会受华体会体育最新地址 中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度的影响，低浓度（<0.7 mM 葡萄糖或<0.1 mM 谷氨酰胺）会降低产品的唾液酸化水平。 据报道，添加某些氨基酸，比如苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸，可以减轻氨的毒性作用。

葡萄糖和谷氨酰胺的负面影响可以通过适当的补料策略来降低至最小，通过控制营养物质的水平并重新定向细胞的代谢方向，可以最大限度的减少乳酸和氨的产生。这种方法应用在批培养中方法中，增加了生物反应器中细胞的数量和单克隆抗体的浓度。

2.2：氨基酸

蛋白质是哺乳动物细胞中最丰富的的组成部分，约占细胞重量的 18%。转染的细胞生产单克隆抗体，同时具有了合成异源蛋白质的额外负担，需要相当数量的相应的氨基酸组件。

哺乳动物细胞无法合成某些必须氨基酸，必须要在华体会体育最新地址 中添加这些氨基酸才能维持细胞生长。尽管细胞可以合成非必须氨基酸，但是一般也会常规的添加到华体会体育最新地址 配方中。添加这些氨基酸可以降低细胞对能量需求，因为不需要再合成氨基酸，细胞就可以将额外的能量转移至单克隆抗体的生产上。

谷氨酰胺是细胞培养中用来产生能量以及蛋白质和核酸合成的必须营养元素，但是在细胞华体会体育最新地址 中，谷氨酰胺非常不稳定，会自发降解，产生副产物氨和吡咯烷酮羧酸。因此，谷氨酰胺通常以二肽的形式提供，这种形式要稳定的多。CHO-GS 细胞系的华体会体育最新地址 中添加谷氨酰胺和天冬酰胺可以有效的缓冲华体会体育最新地址 ，减少乳酸的生成，维持较高的细胞活力并提高抗体的生产效率。酪氨酸在水性溶液总难以溶解，容易沉淀。如果缺少该氨基酸，细胞会在表达单克隆抗体时引入不需要的酪氨酸序列变异，细胞会使用另一种氨基酸来替代酪氨酸。添加含有酪氨酸的二肽元素，可以维持华体会体育最新地址 中高浓度的氨基酸，从而防止营养元素的限制，并减少产品中不必要的一级结构变化。除了营养功能，几种氨基酸，比如苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸对于细胞的压力应急，比如饥饿、高渗透压、高 CO2 或氨，具有保护作用。这些应急状况在批培养过长、高产或者高细胞密度培养中会出现。

2.3：酯类

脂类是所有细胞细胞膜的不可少的结构元素，维持细胞的增殖、生长和存活。脂类占了哺乳动物细胞重量的 5%。 60%的脂类为磷脂，是细胞膜中最丰富的组成部分。在整个的 CHO 细胞中，三种主要的脂类为磷脂（30 fmol /细胞）、胆固醇（10.8 fmol /细胞）和鞘磷脂（1.9 fmol /细胞）。 细胞膜上包含 49%的总磷脂、 64%的胆固醇和 69%的鞘磷脂。起始于乙醇胺和脂肪酸，哺乳动物细胞可以合成磷脂酰乙醇胺，然后以此衍生出其他的磷脂。尽管哺乳动物需要两种必须的脂肪酸，亚油酸和α-亚油酸，才能生长，但是这一需求似乎不适用于哺乳动物细胞的培养。然而，这些脂肪酸，以及硫辛酸和某些磷脂，比如磷脂酰胆碱，通常会包含在基础华体会体育最新地址 配方中。一些细胞系无法合成某系脂质，需要他们在华体会体育最新地址 中包含他们才能生长。 一个例子是鼠骨髓瘤细胞 NS0 对胆固醇有需求，该细胞丢失了胆固醇合成途径中的一种酶。 向细胞培养物中补充非必需磷脂、脂肪酸和固醇可以减少细胞生物合成的需求。哺乳动物细胞对脂质补充的反应不同，但是细胞生长和单克隆抗体产量的改善却是常见的。脂类通常在批培养中作为补料的一部分添加。如果使用一次性反应器来生产单克隆抗体产品，要考虑的一个点是添加的脂类可能会粘附在生物反应器的表面，细胞难以利用。为解决这个问题，在规模扩大之前，需要在小型一次性反应器中研究脂类的补充和利用，并调整其补充已确保细胞具有足够可利用的脂质。脂类是水不溶性的，当添加到华体会体育最新地址 中时需要分散剂。除了传统的载体血清提取物和牛血清白蛋白之外，脂类分散技术还包括乳剂、胶束和脂质体。在无血清华体会体育最新地址 中，环糊精是一种成功使用的分散剂，它是一种吡喃葡萄糖的环状聚合物，可以有效增加脂质的溶解性。环糊精具有双重功能：有效促溶脂类，并通过分子包封将其维持在华体会体育最新地址 中。

对于特定的细胞系，需要确定华体会体育最新地址 中环糊精的最佳浓度及其与胆固醇-脂类的比例，尤其是在一次性生物反应器中培养细胞时。 Okonkowski 等发现，在 Wave 反应器中华体会体育最新地址 中同时存在载体甲基-β-环糊精和线性低密度聚乙烯薄膜足以抑制胆固醇依赖性 NS0 细胞的生长。通过减少添加到华体会体育最新地址 中的过量环糊精，细胞开始使用胆固醇-环糊精复合物作为外源胆固醇的唯一来源。他们提出的生长抑制机制是华体会体育最新地址 中过量的环糊精会从细胞膜中汲取胆固醇，然后不可逆的将胆固醇-环糊精复合物吸附或者截留在 Wave 反应器的线性低密度聚乙烯表面。

2.4：无机离子

哺乳动物细胞需要不同数量的无机离子，他们可以占到细胞总重量的 1%。这些离子通常足量的添加到基础华体会体育最新地址 中，一般不会成为批培养中的限速因子，但是在高密度细胞培养中有可能成为限速因子。大量文献报道无机离子对抗体的表达速率有较大影响。无机离子在华体会体育最新地址 中一般以六种相对浓度水平存在：

（1）非常高的浓度（g/L ） ，比如氯化钠，用来调节华体会体育最新地址 的渗透压，和碳酸氢钠，用来控制华体会体育最新地址 的 pH 值；

（2）高浓度（10-100g/L），包括钙、锂、镁、钾和磷酸盐；

（3）低浓度（每升约数百毫克），包括铁和锌盐；

（4）极低浓度（每升数十毫克），比如铝、钡、钴、铬、铜、氯化物、硒和钛盐；

（5）非常低浓度（低于 1ug/L），比如例如银，锗，溴，碘，锰，钼，钒，镍和锡的盐。 这些无机盐通常作为基础华体会体育最新地址 和/或补料华体会体育最新地址 的成分加入到培养物中。磷元素是核酸、磷脂和其他细胞成分的结构组分。已有证据显示在某些高细胞浓度的培养物中添加磷酸盐可以增加细胞和单克隆抗体产品的产量。铁离子可以使用柠檬酸盐或者 EDTA 以螯合化合物的形式提供，这样就可以消除对转铁蛋白的需求，一种铁转运蛋白。硒也可以作为高效的铁载体，在批培养和摇瓶培养中可以实现高密度（> 10 x 10⁶细胞/ mL）的生长和单克隆抗体的高表达滴度（约 3 g / L）。在不含蛋白质的华体会体育最新地址 中加入锌离子可以完全替代某些杂交瘤细胞，比如 NS0 和 CHO 细胞对添加重组胰岛素的需求，并支持良好的细胞生长和单克隆抗体的表达。

2.5：维生素

哺乳动物细胞生长需要维生素，并且大多数的华体会体育最新地址 配方中都包含足够量的维生素。在典型的高密度生长条件下维生素通常不会成为限速因子。维生素通常作为浓缩补料添加到华体会体育最新地址 来提高生产率。不过有报道称维生素浓度超过正常水平的 35%，会限制 CHO 细胞系的生长。

2.6：补充剂

动物血清是研究实验室或者生产细胞系开发早期经常使用的一种补充剂，但是监管和安全性方面的考虑已经大大减少或者消除了血清的使用，即使是在研发的早期。血清中包含的营养物质、激素、蛋白质和许多其他的直接或间接的刺激细胞生长或具有保护作用的因子，为哺乳动物细胞提供了绝佳的生长培养物质。然而，对于临床和商业化生产而言，使用动物来源的血清存在实际和监管问题，包括血清质量和促进细胞生长能力的可变性，以及对疯牛病病毒和其他动物病毒潜在污染的考虑。正因为这些存在的考虑点，监管机构已经颁布了法规指南，旨在控制并实际上已经不鼓励在任何的生物药物生产阶段使用动物血清。

血清可以用组合的补充剂来代替，比如胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和硒，它们都是无血清配方中最常用的。 来自动物、酵母或者植物源的蛋白水解物也可以作为基础华体会体育最新地址 和补充剂的组分。但是对疯牛病病毒和其他污染性病毒的考虑也适用于这些动物来源的水解产物和蛋白质， 甚至植物来源的水解产物也已证明可能含有能够在 CHO 细胞或其他细胞中增殖的动物病毒。因此，当前的趋势是完全化学成分限定的华体会体育最新地址 ，虽然这是监管和安全的角度上可接受的华体会体育最新地址 ，但是哺乳动物细胞则处于了一个更加挑战性的生长环境。

鉴于工业行业中受污染的原材料的经验，包括细胞华体会体育最新地址 ，监管机构已经明确要求建立新的程序来确保供应链所有组分的安全性，并且企业已经开始执行，以减少生产过程中产品污染的风险。这些程序包括原材料管理和检测的修订，风险评估、技术评估等，这些技术可以使原材料中的病毒失活，比如紫外线处理和伽马射线照射， 有时还会执行核酸检测用于工艺控制。如果需要将胰岛素、转铁蛋白和白蛋白之类的蛋白质添加到华体会体育最新地址 时，优选使用重组来源而非动物来源。使用无蛋白的华体会体育最新地址 和无蛋白的制剂配方可以减少不需要的蛋白质的添加，这些蛋白质可能会影响下游纯化工艺，并且有可能会少量的存在于最终的纯化产品中。许多无血清和无蛋白的华体会体育最新地址 都可以以粉末或者液体的形式，包括浓缩液，在市场上买到。市售或者定制的补充剂可以提供的浓缩营养成分和生长因子，可用于批培养工艺的补料添加。

2.7：其他添加剂

据报道，向华体会体育最新地址 中添加某些化合物，比如丙酸钠和丁酸钠， 可以提高杂交瘤细胞和 CHO细胞的产物产量，虽然机制还不完全清楚，但是似乎跟改善基因的可及性而增加重链和轻链基因的转录有关。最近还加入了金三羧酸作为转铁蛋白的合成替代物，并且发现其在 CHO 细胞中具有胰岛素样生长刺激因子的作用，可用于某些生产工艺过程。己酸异羟肟酸已显示可将 CHO 细胞中单克隆抗体的产量提高 40%。有报道称戊酸可以提高 CHO 细胞培养中的蛋白产量。丙戊酸（VPA， 2-丙基戊酸）是组蛋白脱乙酰基酶的支链羧酸抑制剂。 在华体会体育最新地址 中添加后，发现对稳定表达单克隆抗体的三种 CHO 细胞系中，其中两种可以增加单克隆抗体的表达滴度，其中一种是强大程度的提高，另一种是中等程度的提高。通常还会加入诸如 Tween 80 和 Pluronic F-68 之类的表面活性剂添加到细胞华体会体育最新地址 中，以保护细胞免受生物反应器中搅拌和鼓泡的剪切力和表面气泡破裂引起的流体动力学损害。细胞培养工艺的开发涉及测试各种市售的或者定制的华体会体育最新地址 培养，这些配方包含部分或者全部的添加剂，和补料华体会体育最新地址 和补料策略，以确定针对特定的生产细胞系的最佳组合。即使是具有共同起源的克隆细胞系在华体会体育最新地址 中的行为也可能不同，主要是因为转基因的未知表观遗传作用或者转基因的整合作用。 因此，与通常基于亲本细胞系开发的平台工艺相比，特定的工艺开发通常能提供一个更好的工艺。

三补料开发策略

使用补料培养可以防止重要华体会体育最新地址 成分的消耗，从而提高细胞培养的时间和细胞产品的产量。现在市售的有多种可用于 CHO 细胞和其他生产细胞系的补料配方。补料开发涉及对已消耗的华体会体育最新地址 的分析，计算氨基酸和维生素等营养物质的具体消耗率，配制浓缩的营养物华体会体育最新地址 ，使每对营养物的比例等于其特定的消耗率。通过这种方式配制华体会体育最新地址 的想法是，通过补料可以将消耗的营养物恢复到其基础水平，从而将所有的营养物恢复至其基础水平。当前大规模哺乳动物细胞培养的行业惯例通常是采用标准平台的批培养工艺，每隔一定的间隔时间进行固定体积的大剂量补料。最近的一些关于补料策略发展的工作涉及自动监测和动态补料，并使用一定算法来改变补料速率。 Lu 等人描述了一种简单的批培养优化的策略，补料华体会体育最新地址 的开发是建立在已消耗华体会体育最新地址 的分析上，并且建立一个补料策略，即在脱机检测华体会体育最新地址 相关营养组分的浓度之后以特定的间隔添加可变体积的补料华体会体育最新地址 。

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