二. 纯化策略的选择

1，以最终目标为导向确定纯化策略

以蛋白纯度为例：

应用	纯度要求	纯化步数
治疗，体内研究	>99%	≥3步
蛋白晶体学研究	95~99%	2~3步
制备抗原，N端测序	<95%	1~2步

纯化蛋白中残留杂质：

需要明确含有的杂质是否会对蛋白的后续应用造成影响。

杂质对应用无影响-----允许少量残留

杂质对应用有影响-----需完全清除残留杂质

2，蛋白质性质及其对纯化策略的影响

样品和目标蛋白质特性	对纯化策略的影响
温度稳定性	是否需要低温环境
pH稳定性	纯化过程Buffer的选择
去污剂要求	后续能否去除
离子强度	蛋白在其中的稳定性
对蛋白酶敏感	快速去除蛋白酶/加抑制剂
对金属离子敏感	加EDTA/EGTA
氧化敏感性	加还原剂
等电点	据此选择纯化pH
生物特异亲和力	选择纯化填料种类
溶解性	是否需要添加变性剂

→对样品及目标蛋白的性质了解越多，则对纯化策略的确定越有利，越容易增加实验的成功率，以最少的原料及最短的时间获得目标蛋白

三，样品的准备

原则：

1.尽量减少样品处理的步骤

2.尽量减少添加剂的使用

3.尽早去除有害杂质

目的：

从原料中初步分离目标蛋白，主要是去除颗粒物或与色谱法不相容的杂质，制备澄清样品用于纯化

样品准备一般采用的方法

1.目标蛋白来自于原核细胞表达

通常来自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌

若来自与大肠杆菌表达：通常先使用离心的方式分离出菌体和发酵液。如果是分泌表达，则收集上清液；如果是胞内表达，则收集菌体，加入破碎菌体的缓冲液重新悬浮菌体(通常1g的菌体加入5~10ml的缓冲液)，放于冰浴中，使用超声波进行破碎或者使用高压匀质机进行破碎，菌体破碎完成后可以使用离心的方式或膜包或者中空纤维素膜分离出不溶沉淀和可溶上清液。如果目标蛋白是可溶的则收集上清液即可，如果目标蛋白不可溶(也称包涵体)，则收集沉淀即可。对于不可溶蛋白需要加入变性剂对其进行溶解，通常使用的变性剂为尿素和盐酸胍

对于枯草芽孢杆菌，通常为分泌表达，可以使用离心的方式或膜包或者中空纤维素膜分离出菌体，收获上清液即可

2.目标蛋白来自于酵母细胞表达

一般目标蛋白为可溶表达，通常为分泌表达，可以使用离心的方式或膜包或者中空纤维素膜分。离出菌体，收获上清液即可

3.目标蛋白来自于哺乳动物细胞表达

一般目标蛋白为可溶表达，通常为分泌表达，可以使用离心的方式或膜包过滤方式分离出细胞，收获上清液即可

4.目标蛋白来自于昆虫细胞表达

一般目标蛋白为可溶表达，通常为分泌表达，可以使用离心的方式或膜包过滤方式分离出细胞，收获上清液即可

样品的澄清

获得含有目标蛋白的样品溶液后，如果接下来使用凝胶过滤的方式进行对目标蛋白进行纯化，一般需要对样品溶液进行过滤处理，以防未去除干净的小颗粒阻塞凝胶填料。通常使用0.45um的滤膜对样品进行过滤即可。

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