各纯化阶段需重点考虑因素：

1，目标蛋白的捕获

2，中度纯化

3，精纯

第一阶段：捕获目标蛋白

定义：从粗品或澄清后样品中初步纯化目标分子，该分离步骤的主要目标是快速分离、稳定和浓缩目标蛋白

Tip1：使用高容量浓缩技术减少样品体积，在使用更小的层析柱条件下使纯化速度更快

Tip2：在第一步纯化时，关注稳定性和简便性。不要试图在粗样品纯化时通过一步纯化解决所有问题。

捕获目标蛋白阶段，主要是通过优化上样流速和层析填料的载量来有效的获取、稳定和浓缩目标蛋白。该步骤最常用的填料为：离子交换填料和亲和层析填料

对目标蛋白的结合载量是捕获阶段最关键的参数，需要最先对其进行条件优化。比如使用离子交换填料初步从样品中进行捕获蛋白时，其主要目标是通过条件的优化尽可能多的快速捕获目标蛋白并且尽可能少的结合杂蛋白，提高对目标蛋白的载量。

使用离子交换填料纯化时，在洗脱步骤通常采用分步洗脱的方式，在较短的时间并且消耗缓冲液较少的条件下摸索出合适的洗脱条件

放大生产捕获目标蛋白：

在进行放大生产时，方法开发过程需要重点关注其生产通量，包括样品的提纯和澄清，样品的上样载量，层析填料在平衡，上样，洗杂，洗脱及柱填料的清洗等各步骤的流速。

原则上，捕获蛋白阶段需要使填料载量最大化，流速最大化，即使这样操作可能使填料的分辨率有所降低。然而对于一些特殊的高价值蛋白的捕获，其回收率也应考虑在工艺开发范围内，对其捕获可能需要较高的分辨率，这就需要降低填料的载量及流速。

第二阶段：中度纯化

该阶段进一步去除大量杂质，进一步提纯并浓缩目标蛋白

中度纯化主要是将目标蛋白中含有的其它杂蛋白，核酸，内毒素，病毒等物质去除。该阶段对分辨率的要求主要取决于捕获步骤产生的样品状态以及对最终产品的纯度要求。为保证生产能力，该阶段对层析填料的载量和分辨率均有很高的要求。

中度纯化过程中，上样流速变得不是很关键，因为在捕获步骤中，导致蛋白质分解或其他破坏性影响的杂质已被去除，样品体积也减少很多

在中度纯化阶段优化纯化工艺时，需要在层析填料的载量和分辨率找到最佳的平衡

第三阶段：精纯

该阶段在中度纯化的基础上进一步去除痕量的杂质，同时可以调节pH，盐浓度以及加入添加剂使目标蛋白处在后续保存的溶液中

此阶段主要去除中度纯化完成后目标蛋白溶液残留的痕量内毒素、核酸、病毒，以及目标蛋白的异构体，聚体等。在此阶段，为了使层析填料获得较高的分辨率，可能会牺牲样品的上样量及回收率。在保证分辨率满足要求的情况下，尽可能提高样品的回收率，因为此阶段的目标蛋白比前两个阶段要珍贵的多。

下期预告：His标签蛋白纯化

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