实验试剂：

质粒(干粉)

大肠杆菌感受态细胞(100uL/管)

TE：10mM Tris-HCl ,1mM EDTA， PH=8.0

LB：试管4ml；含抗生素的LB固体平板

抗性：Amp+（100mg/ml）或 Kan+（30mg/ml）或其他抗生素

保种甘油：浓度50% ，体积50ml

IPTG(浓度1M)

1 x PBS

2 x Loading Buffer

电泳缓冲液，染色液，脱色液

ddH2O

实验仪器：

冰箱（4℃）

超低温冰箱（-80℃）

水浴锅（0~100℃）

摇床（15~37℃；250rpm)

培养箱（37℃）

可见分光光度计（测OD600）

离心机（Max>6000rpm)

煮样器（室温~100℃)

电泳仪

实验步骤：

第一天任务：

1.将装有质粒的离心管放入离心机中，离心（5000r/min；1min)

2.向离心后的质粒离心管中加入TE并混匀，使质粒的浓度为80~100ng/uL

3.吸取1μL质粒溶液加入至100uL的大肠杆菌感受态细胞中并轻轻吹打混匀

4.将感受态细胞放入冰浴中，30min

5.取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,

6.再次放入冰浴中，2~3min

7.吸取200μL的LB液体华体会体育最新地址 加入到已转化质粒的感受态细胞中

8.放入摇床，37℃，180rpm，培养45min

9.吸取50μL悬液加入至相应抗性的LB固体平板中(可提前将对应抗性的抗性平板放入37℃培养箱中中预热），用涂布棒涂布均匀

10.把平板倒置放入培养箱中，37℃，过夜培养

第二天的任务：

1.每个平板挑取3个单菌落加入至对应抗性的LB（4ml）试管中，编号为A , B, C

2.将试管放入摇床中，37℃，180rpm) 中，培养至OD值约为0.6至0.8(培养时间约3~4h即可达到此浓度)

3.从各试管中分别取700μL菌悬液加入到300μL（C=50%）的保种甘油中，吹打混匀，可先放入-20℃冰箱冻存，然后转入-80℃冰箱冻存

4.向各试管剩余的菌液中分别加入1.65μL的IPTG(浓度1M)

5.根据不同的质粒载体选择合适的表达环境（如果质粒载体为PET或PGEX，则诱导条件为15℃过夜诱导表达或25℃诱导表达6h，也可使用37℃诱导表达3~4h。如果质粒载体为Pcold，则使用15℃过夜诱导表达。

第三天任务：

1.从诱导表达后的试管中分别吸取500μL菌液加入到1.5ml离心管中，(若菌体浓度较低，可多取一些体积），6000rpm，离心5min, 去上清，留沉淀

2.再向各离心管中分别加入500μL的ddH2O,吹打重悬沉淀，放入离心机，6000pm，离心5min, 去上清，留沉淀

3.向各离心管中分别加入50μL的1×PBS和50μL的2×Loading Buffer吹打重悬菌体

4.将离心管放入煮样器，100℃加热5~10min，以使菌体破碎

5.取出离心管，放入离心机中，6000rpm，离心3~5min, 吸取10uL上清液进行SDS-PAGE电泳检测。

6.根据电泳结果，选择表达量高的菌株作为种子库，后续的实验可使用该表达量高的菌种。