肝素填料介绍

原理：肝素是由等摩尔量葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过α（1-4）糖苷键连接组成的线性糖胺聚糖，它的一些羟基与硫酸部分酯化，分子有一个还原糖末端。偶联在填料上的肝素主要有两种模式与蛋白发生结合作用，1.用作亲和填料，通过亲和作用与生长因子和抗凝血酶III，凝血因子产生结合，2.因为含有硫酸基团，因此可以用作阳离子交换填料，可以与脂蛋白或酯酶结合，如LDL, VLDL, VLDL脱辅基蛋白, HDL等；还可以与DNA或RNA结合蛋白进行结合；此外还能结合生长激素、生长因子FGF和ECGF、胶原酶、限制性内切酶，透明质酸酶、溶菌酶、蛋白酶等。有些蛋白质通常可以通过亲和方式和离子交换方式组合与肝素进行结合，即使蛋白之间有很小的差异，也能得到很好的分离

由于肝素填料可以结合的物质种类较多，因此其应用也非常广泛

1.肝素填料的使用方法

所需试剂：

平衡/洗杂Buffer：1X PBS 或10mM Tris-HCl， 150mM NaCl ，pH7.4

洗脱Buffer：PBS或Tris Buffer加1.5M~2M NaCl

实验步骤：

1.将肝素填料装入层析柱中，使用大于5倍填料体积的平衡Buffer对填料进行平衡

2.将样品进行上样过柱，上样流速不必过快

3.使用10倍填料体积以上的洗杂Buffer清洗填料

4.使用3~5倍填料体积的洗脱Buffer对进行洗脱，收集洗脱液时可以分管进行收集

5.填料再生：先使用2~3倍填料体积的含8M尿素，1.5M NaCL的PBS过柱，最后在使用3~5倍平衡Buufer过柱，加入终浓度为0.02%的叠氮化钠放于 4 ℃储存

★在洗杂时，可以通过适当增加NaCl浓度的进行洗杂，以尽可能多的除去杂蛋白

★洗脱时，如果有多种蛋白都可以和填料结合，可以通过逐渐提高洗脱液中NaCl浓度的方式进行线性洗脱或者分步洗脱

2.对填料进行CIP

肝素填料经过再生处理，有些蛋白仍然残留在填料上，这就需要通过CIP的方式对这些残留蛋白进行清洗去除，其处理方式为，使用0.1M NaOH流动冲洗填料1~2h,流速不必太快，再使用5倍填料体积的PBS平衡即可

3.对填料进行消毒灭菌

可以使用含0.1M NaOH的20%乙醇溶液流动冲洗填料1~2h，或者可以使用70%乙醇溶液处理填料12h。完成消毒后，再使用PBS平衡填料即可

FAQ

1.洗脱组分中无目的蛋白

①选择的样品缓冲液不合适→处理样品时换用其他缓冲液

②样品中的盐离子浓度过高→上柱前先将样品透析至平衡Buffer中

2.洗脱的蛋白中含有大量杂蛋白

①一步洗脱将目标蛋白和杂蛋白一起洗脱下来→使用线性洗脱或分步洗脱的方式

②杂蛋白与目标蛋白有非特异性吸附→在洗杂Buffer中加入TritonX-100或其他非离子型去污剂

3.填料使用后变色

样品中的色素结合在填料上→上样前要先去除样品中的色素

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