1.离子交换填料的消毒

在某些纯度要求较高的生化产品制备过程中，往往要求对分离介质进行消毒处理，以防止微生物等杂质混入目标产品中

采用高温消毒是最常用的方法，目前大多数离子交换剂具有稳定的物理化学性能，均可进行高温消毒处理。但在使用多糖类介质时，必须注意，介质一定要处于盐型，而且要在中性条件下才能进行高温消毒处理，否则将会导致多糖大分子骨架的降解，严重影响介质的使用寿命

NaOH也是一种很好的消毒剂，但要根据介质的耐碱程度和微生物污染的种类、污染程度选用合适浓度的NaOH。这种消毒方法也可以采用柱内浸泡法，即将一定浓度的NaOH通入柱中，关闭出液阀，浸泡几个小时后，可达到消毒的目的。NaOH如果与乙醇合用，可以得到更佳的效果。用NaOH消毒还可将消毒和在位清洗合并处理

2.填料的“复苏”

在生化分离过程中，由于分离体系较为复杂，含有多种蛋白质或其他杂质，因此在使用过程中常出现树脂的“中毒”现象。中毒原因可能是由于大分子的多点带电，与介质进行多点结合，致使难以洗脱，使介质的有效功能基团减少。也可能是一些较大的分子被“卡牢”在孔道内，难以扩散出来，堵塞了孔道，在以后的交换过程中影响到颗粒内功能基团的有效工作。除生物大分子外，色素及腐殖酸等都可使介质中毒。有时工作液中的胶状物质被粘附于介质颗粒的内外表面，覆盖了功能基团，这也是影响介质工作容量的重要因素

由于上述原因，离子交换层析介质在使用一段时间后，可能出现颜色变深、床体收缩、分辨率下降、蛋白质收率降低、反压升高等现象。此时，需要对介质进行净化处理。对于介质用量比较大，自动化程度比较高的规模生产，应采用在原交换柱内进行，即“在位清洗”。先从交换柱的下面通过适量的清水，目的是去除交换柱中的悬浮物，并将床体疏松，还可以将结块的介质分散，有利于以后介质与清洗液的接触。对于一般的污染，采用逆流清洗，可减少污染物对下层介质的污染。应根据介质种类及污染程度的不同，分别选用不同种类的清洗剂及不同的清洗步骤。一般的介质是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分阶段清洗或浸泡，各试剂交替之间须用去离子水洗至中性。若经过上述处理后仍无明显改善，尤其是流速无明显提高，则要检查交换柱布水器的纱网是否出现堵塞。

上述过程即为通常所说的“复苏”过程。不同的介质应选用不同的复苏方法，主要取决于介质的物理化学性能及污染物质的性质。对于多糖类的离子交换剂，每当使用一段时间后，可采用离子浓度较大的缓冲液通过交换柱或浸泡介质，因为缓冲液的离子强度较大时，有利于蛋白质大分子脱离介质，达到复苏的效果。对于物化结构稳定的介质，也可使用NaCl溶液通过交换柱或浸泡介质。对于物化结构非常稳定的介质，可用30℃~40℃的乙醇或丙酮进行洗脱或浸泡，在高温下可使吸附在介质上的蛋白变性或加快扩散速度，也有利于胶体物质的破坏，从而使污染物脱离介质。还可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl，更有利于介质的复苏

清除沉淀蛋白、脂类、疏水性的蛋白及脂蛋白，处理步骤更为复杂。可采用100%的异丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的盐酸胍、阳离子或非离子洗涤剂等作为处理液。在用过这些清洗剂后，都要用至少2倍体积的蒸馏水进行清洗。使用有机溶剂后，交换柱要采用锯齿形的梯度洗涤进行清洗，即可以在5倍床体积内，使溶剂的含量从0增至100%，然后在下一个5倍床体积中，使溶剂的含量从100%降到0

如果经过上述处理，交换柱的工作情况仍没有恢复，可以使用蛋白水解酶，将仍滞留在介质内的蛋白质进行水解，使其脱离介质。可以采用含有1mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交换柱中，在室温下浸泡过夜，或在37℃下浸泡一小时。根据污染物的情况，也可以采用DNA酶等其它的酶类。无论使用哪一种酶处理后，都要重复上述清除污染物的清洗步骤，把酶清洗干净

脂蛋白对分离介质的污染比较严重，因为脂蛋白及其它脂类物质，很容易粘附在层析柱内，最好在进行分离工艺前先将其去除。推荐使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀剂，可去除高含量的脂蛋白

3.填料的贮存

各种分离介质在使用后都要进行清洗后再贮存，这对于多糖类分离介质尤为重要。分离介质在使用后，先用2个床体积的清水清洗，然后用2个床体积的20%的乙醇过柱。对于SP强酸性阳离子介质，要用含有0.2mol/L乙酸钠的20%乙醇溶液清洗，再用脱气的乙醇-水溶液以较慢的流速清洗。经过处理后，可在室温下贮存，或在4~8℃下长期存放。贮存过程中必须将层析柱全部封闭，以防止水分的挥发，造成干柱。暂时不用的介质必须贮存在20%的乙醇溶液中。所有的离子交换分离介质，都要在4℃~30℃的条件下贮存，并防止冷冻。

离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一

未经允许不得转载：hth网页入口»蛋白纯化系列十四：离子交换填料简介(3)