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前言

2021年12月6日，完整版《2021IDF全球糖尿病地图（第10版)》于国际糖尿病联合会（IDF）官网发布，指出:糖尿病是21世纪增长最快的全球突发卫生事件之一，作为重大的健康问题，其已经达到了令人担忧的程度。数据显示2021年全球成年糖尿病患者达到5.37亿，中国糖尿病患者人数已经超过1.1亿;预计到2030年和2045年，全球糖尿病患者总数将增长6.43亿和7.83亿。这些数据说明人胰岛素的场需求量仍然很大，需要基因工程技术在重组蛋白生产上不断做出突破和提高

近年来利用基因工程进行蛋白质大规模生产的需求不断提升，特别是在利用工程菌株进行原核表达方面，因此提高外源蛋白表达量的研究一直是热门的研究主题之一。随着翻译效率相关研究不断深入，翻译效率模型考虑到的因素也在不断拓展，主要包括密码子顺序、局部 tRNA丰度、tRNA基因表达调控以及对核糖体、mRNA结构和肽链折叠耗能的需求等。其中关于tRNA可用性的研究较为广泛。翻译过程中，tRNA可视为运输原料氨基酸的工具，两者之间较高的共适应性关系有利于蛋白质的高效合成。因此可以推测，tRNA基因和相应氨基酸的水平应该很好地匹配来更有效地合成蛋白质。这样的一致性将使翻译效率最大化，同时使资源/能源成本最小化。并且在生物体尺度上提出了tRNA基因拷贝数和氨基酸组成之间存在共适应关系，并通过计算两者间秩相关指数TAAI (tRNA GeneCopy Num ber and Amino Acid Usage Accordance Index）来衡量这种共适应性。

星耀小TIP：TAAI指数是通过对物种 tRNA基因拷贝数和氨基酸组成之间进行秩相关( Spearman correlation）分析得到，用以衡量两者之间共适应性关系。

接下来菌菌就以大肠杆菌基因组 tRNA基因拷贝数和氨基酸组成适应性相关指数TAAI作为理论指导，以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主菌,实验验证通过操纵大肠杆菌tRNA基因拷贝数增加来实现外源蛋白质表达量的提高。根据大肠杆菌基因组 TAAI计算结果选出了ileU，glyX，alaW，valV，gluW，aspU和 serV共7种增加拷贝数可提高TAAI值的tRNA基因类型，并选取质粒pACYC-Duetl，分别构建了7种重组载体，方便应用于外源蛋白质表达研究。然后分别选取pACYC-Duetl载体、插入tRNA基因拷贝aspU的载体和插入7种 tRNA基因合成片段PT7tRNA 的载体，进行外源蛋白诱导表达实验，并分析蛋白表达量差异。结果发现插入单拷贝tRNA 基因的载体外源蛋白表达量较空载载体高，但差异性不显著;插入PT7tRNA片段的载体较空载载体外源蛋白表达量有显著提高，并且提高量达到了21%。

实验材料

菌株：大肠杆菌T1菌株和BL21(DE3)T1感受态细胞是目前生长速度最快的感受态细胞，适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，减少克隆DNA同源重组的发生，提高质粒DNA 的产量和质量。大肠杆菌BL21(DE3)是最常用的外源蛋白表达宿主菌。该菌株染色体上携带由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因，故在IPTG诱导下，可以高效表达T7启动子驱动的外源基因;并且缺失lon和ompT两个蛋白酶基因，有利于外源蛋白的纯化。

载体：pACYC-DuetltRNA基因的表达载体选定为pACYC-Duetl，因为它携带中度拷贝复制子pl5A，拷贝数为10~12个，不会造成因tRNA基因过表达而危害细胞稳态的结果。pACYC-Duetl载体有两个表达区，其中启动子为T7启动子，由IPTG诱导调控。T7启动子不被大肠杆菌RNA聚合酶识别，T7RNA聚合酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株的L8-UV5 lac启动子控制下进行染色体整合，因此大肠杆菌BL21(DE3)适合于非毒性蛋白表达。下图为pACYC-Duetl载体的质粒图谱。

pACYC-Duet1载体的质粒图谱

实验方法

大肠杆菌感受态细胞制备（详情可见【菌周刊】大肠杆菌Red同源重组敲除—感受态细胞的制备）
质粒的化学转化：1）将T1感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上，待其融化;2）使用微量移液器将适量待转化的质粒（纯质粒2 ul即可，重组载体或连接产物则需全部用于转化）加入约80 ul T1感受态菌液中，冰浴处理30 min;3）水浴锅中42℃热激处理90 s;4）立即冰浴处理3-5 min;5）在超净工作台中向装有Tl菌液的离心管中加入300 ul 的LB培养液或soc，将离心管置于摇床中37℃，190 rpm 条件下振荡培养40 min，使得菌液复苏;6）从离心管中各取适量菌液均匀涂布在Chl+抗性LB板上(纯质粒转化菌液涂100 ul即可;重组载体或连接产物则需浓缩之后涂布全部菌液)，置于恒温培养箱中37℃过夜培养。

质粒的电转化1）从-80℃冰箱取出保存的BL21电转感受态细胞，置于冰上解冻2ul）用微量移液器将适量待转化的质粒（纯质粒2 ul即可，重组载体或连接产物则需全部用于转化）加入约80 ul BL21(DE3)感受态菌液中，吹打混匀，置于冰上放置10 min;3）电转仪设定大肠杆菌Ecl/1800V模式，用微量移液器将感受态细胞转移至电击杯中，进行电击;4）取出电击杯后立即向其中加入300 ul液体LB华体会体育最新地址 ，吹打两次并转至离心管中，37℃，190 rpm 振荡培养40 min-1 h，进行活性复苏;5）从离心管中各取适量菌液均匀涂布在Chl+抗性LB板上（用于涂板的菌液量与化学转化相同)，置于恒温培养箱中37℃过夜培养。

PCR扩增反应PCR反应程序设定如下

X值即退火温度，根据引物和模板确定。Y值即为延伸时间，由目的片段长度和 DNA聚合酶确定。

琼脂糖凝胶电泳1）根椐目的基因大小选定合适胶浓度，在玻璃锥形瓶中将准确称量的琼脂糖粉溶解于适量的电泳缓冲液（缓冲液体积不宜超过锥形瓶容量的一半);2）用牛皮纸封闭锥形瓶的瓶口(在牛皮纸上扎些小孔以保证透气性)，然后在微波炉中加热3-4 min促进溶解琼脂糖。加热过程中，在缓冲液煮沸后，戴上隔热手套取出锥形瓶小心摇动5-6次后放回微波炉继续煮沸,重复此操作若干次，直至缓冲液变得透明清亮;3）取出锥形瓶置于室温中使溶液冷却至60℃以下，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液(终浓度0.5 ug/ml)或按照1 ul /30 ml的比例加入DNA green染料，并摇动锥形瓶充分混匀;4）将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在制胶模凹槽位置插上梳子等待凝胶完成。凝胶厚度一般在3-5 mm之间。小胶配制需要琼脂糖溶液约30 mL，大胶则需70 ml左右，对于切胶回收情况，凝胶可略微提高厚度;5）琼脂糖凝胶制备好之后，取适量DNA样品与上样缓冲液（6x LoadingBuffer）混匀（样品与缓冲液体积比为1:5);6）用微量移液器小心向点样孔中加样，加样量可根据样品浓度适量调整，每个点样孔加样量需要一致且不超过点样孔容量（一般小孔容量40 ul，大孔容量200 ul);7）加完样后，设置电泳仪电压为恒压110 V，开始进行电泳;8）当条带移动到距离胶底部边缘约2 cm处时，结束电泳;在蛋白核酸分析仪中观察是否有目的条带。

菌落PCR验证方法质粒转化进入大肠杆菌之后，待固体华体会体育最新地址 上菌落长好之后，需要检测质粒是否成功进入大肠杆菌胞质中。因此需要进行菌落PCR验证，具体实验方法如下:1）利用软件Oligo 7 设计上下游引物（引物扩增出来的片段必须包含载体上的部分或全部序列);2)从固体培养板上随机挑取3-5处菌落至装有20 ul灭菌ddH2O的离心管中，吹打混匀;3）以上述菌液作为模板，进行PCR扩增反应，具体方法见2.2.3小节;4）进行琼脂糖凝胶电泳;4)进行琼脂糖凝胶电泳;

PCR扩增产物纯化回收Universal DNA 纯化回收试剂盒从TAE琼脂糖凝胶中回收 DNA片段。质粒提取1）待提取质粒的大肠杆菌菌株首先在含氯霉素的LB液体华体会体育最新地址 中过夜振荡培养，条件设定为37℃，220 rpm 。2)过夜培养得到的菌种保种两管。具体方法是取1.5 ml离心管，加入500 ul体积分数50%的甘油，再取500 ul菌液，用封口膜密封，保存于-20℃冰箱中。3)菌液提质粒用质粒小提试剂盒。

Gibson组装技术Gibson组装(Gibson assembly）技术因可实现轻松组装多个线性 DNA片段且连接后无痕迹而著名，也可以应用于将一个目的片段插入选定的载体中完成基因克隆。Gibson组装技术利用T5核酸外切酶、DNA聚合酶和连接酶的协同作用将多个末端带有重叠序列的DNA片段组装起来。

大肠杆菌外源蛋白诱导表达1）从菌落长好的固体华体会体育最新地址 中挑取单菌落至5 ml含有100 ug/ml氯霉素的LB华体会体育最新地址 中，在37℃，220 rpm条件下过夜振荡扩培，培养12-16 h;2)取过夜培养得到的种子液用分光光度计测定OD6oo值。之后利用含有100ug/ml氯霉素的LB华体会体育最新地址 稀释种子液，得到OD6oo值为0.02的总体积4 ml的菌液，37℃，220 rpm条件下在摇床中继续培养;3）培养至菌液OD6oo值为0.4-0.6时加入适宜浓度的IPTG诱导剂，继续振荡培养4h后取出;即可进行菌液蛋白质提取。

大肠杆菌胞内蛋白质提取1）收集菌液。将IPTG诱导培养得到的菌液转移到2ml离心管中，在离心机中 8000 rpm离心3 min，弃去上清液（菌液超过2 ml分批离心);2）用1x PBS (pH=7.2-7.4）洗涤沉淀2次，8000 rpm离心 3 min;3)每管菌液离心得到的沉淀用4 ul蛋白酶抑制剂和400 ul BeyoLyticTM细菌活性蛋白提取试剂的混合液进行重悬，可短暂涡旋混合以充分重悬，室温孵育15 min;4) 12000 rpm离心20 min，小心吸取上清液，即为抽提获得的可溶性蛋白;用lx PBS洗涤沉淀2次，重悬于300 ul的 PBS，作为包涵体定量，加入等体积的上样缓冲液1x Loading Buffer。

大肠杆菌生长情况测定细胞生长曲线是判定细胞活力的重要指标。细菌在传代培养过程中依次经历迟缓期（Lag ph ase)，对数或指数生长期（Logarithmic or Exponential phage)，稳定期(Stationary phase）和衰亡期(Decline phase）四个阶段。在迟缓期少量的细菌接种到新鲜的LB液体华体会体育最新地址 中，并在37℃条件下进行培养，此时细菌会需要短暂的时间来适应新环境，因此细菌繁殖较缓慢;在指数生长期细菌已适应环境条件，且由于营养条件充足以及无竞争压力开始呈指数速度生长;随着营养消耗以及竞争压力加强，细菌生长速率逐渐下降，死亡率逐渐上升，活菌总量趋于稳定，该阶段即为稳定期阶段;最后随着培养环境中营养物质减少、毒性物质增多，细菌死亡率逐渐超过生长率，活菌总量逐渐减少，细菌生长周期进入衰亡期。其中指数生长期阶段细菌生命状态最佳，且对环境条件变化最敏感，因此最适宜在该阶段施加抗生素条件。

BCA 法测定蛋白质浓度BCA法是利用了蛋白质-染料结合的原理来定量地测定蛋白质浓度。1)BCA法测蛋白浓度首先需要制备蛋白标准品即牛血清蛋白(BSA)溶液，终浓度为0.5 mg/m1;2）配制BSA标准蛋白质浓度梯度溶液，配制体系见表2-9;3)在96孔板中加入20 ul蛋白质样品，包括BSA蛋白质梯度溶液和待测蛋白液（浓度过高时需适量倍数稀释>;4）配制BCA工作液，BCA试剂A: BCA试剂B=50:1的体积比进行混合配制。在每个蛋白样品中加入200 u1工作液;5）恒温40℃条件下96孔板静置40 min，用酶标仪测定蛋白液吸光度值，绘制OD6oo值-蛋白质浓度标准曲线，计算各蛋白样品浓度。

结果分析

大肠杆菌基因组TAAI计算首先要做的是通过搜集大肠杆菌基因组、蛋白质组和 tRNA基因相关的可靠数据，计算相关TAAI值。并以TAAI作为理论指导，确定可以提高大肠杆菌翻译效率的tRNA 基因。根据已有研究发现,大肠杆菌中通过操纵tRNA基因拷贝数来优化外源蛋白与宿主tRNA基因之间的共适应性即提高TAAI值可以提升外源蛋白翻译速率。研究中，首先计算大肠杆菌BL21基因组TAAI值，之后将tRNA基因根据其与氨基酸的对应关系进行分类，然后分别计算每类tRNA 基因增加一个拷贝之后大肠杆菌基因组TAAI值，并算出TAAI变化情况。最后确定出 TAAI增加的tRNA种类，继续进行接下来的蛋白质表达实验。物种基因组TAAI是通过对tRNA 基因拷贝数和氨基酸组成进行秩相关分析得到，即计算两者间Spearman相关系数。下表列出了20种氨基酸对应 tRNA基因拷贝数改变后大肠杆菌基因组 TAAI的变化情况。

根据表中大肠杆菌基因组TAAI变化情况，可以看出有7种tRNA基因增加拷贝数可以提高tRNA基因与氨基酸组成的适应性相关指数。因此接下来的大肠杆菌中的蛋白质表达实验研究的是氨基酸Ile，Gly，Ala，Val，Glu，Asp和 Ser对应的 tRNA基因拷贝导入大肠杆菌中对其外源蛋白表达量的影响情况。

大肠杆菌生长情况测定将tRNA基因拷贝插入载体并转化之后得到的菌株分两次进行生长曲线测定，按照额外tRNA基因拷贝插入载体先后顺序进行。首先测定大肠杆菌BL21-pAcYC-Duet1 ,BL21-pACYC-AlaW ，BL21-pAcYC-serV和BL21-pAcYC-ValV菌株，具体生长曲线测定过程见2.2.11小节。每个菌种随机选3个单菌株放入生长曲线动态监测系统测定生长情况，培养24 h后处理数据，使用GrowthRates软件计算生长速率。接下来以相同方法测定菌种BL21-pACYC-Duet1 ,BL21-pACYC-glyX，BL21-pACYC-gluW，BL21-pAcYc-ileU和 BL21-pACYC-aspU的生长数据，并利用GrowthRates软件计算生长速率。

外源蛋白表达量测定在已确定最优诱导条件下﹐对菌株BL21-Duet-GroEL，BL21-Duet-A sp-GroEL和 BL21-Duet-7t-GroEL进行外源蛋白质诱导表达，然后提取细菌胞质蛋白，通过BCA方法测定蛋白质浓度。接下来对得到的蛋白质样品进行SDS-PAGE和Western Blot定量检测。

分析总结

实验验证通过人工操纵tRNA基因拷贝数的增加来提高物种基因组共适应性指数TAAI的方法可以实现外源蛋白表达量的提高。搜集了26种常用于外源蛋白表达的工程菌和真核宿主细胞，分别计算了物种基因组水平氨基酸组成和tRNA基因拷贝数之间共适应性指数TAAI，并统计了各物种TAAI增加对应的tRNA基因种类。统计结果发现，原核物种中增加氨基酸Asn， Tyr，Cys和Met对应的tRNA基因拷贝数后基因组TAAI均不会提高,而增加氨基酸Ala，Leu和Ie对应的 tRNA基因拷贝数后基因组TAAI则会普遍提高。真核物种基因组TAAI改变相关规律不明显。接下来利用ImageJ软件测算蛋白质条带灰度值，并利用电泳样品总蛋白量进行归一化处理，统计分析不同菌株之间外源蛋白表达的差异性结果。GraphPad软件作图结果如下所示:

参考文献：

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