经过前两期的菌周刊，小编相信大家对大肠杆菌RED同源重组技术已经有了相对充分的了解，今天作为收尾，我们结合案例就来讲讲在重组敲除领域中感受态细胞的制备。

以耀海生物成功为上海某明星企业提供了重组质粒构建的服务中所用的感受态细胞为例。客户的需求是将目的基因片段连入载体构建成含有目的基因片段的重组质粒并获得相应菌株。为满足客户目的首先需要找到需要的目标基因片段，那么确定目的基因片段呢？这就需要通过含有目标菌株的感受态细胞来与野生菌株进行比较以便确认，由此可见感受态细胞的制备对于整个项目而言是前提，直接关乎整个项目的基础。

那么至关重要的感受态细胞是如何制备出来的呢？为了更好的回答这个问题，首先需要了解一下感受态细胞的起源及原理。

大肠杆菌感受态细胞制备的渊源

目前用于细菌转化的化学方法大部分是建立在Mandel和Higa (1970) 的工作基础之上，他们开发了一种用λ噬菌体DNA转染大肠杆菌的方法。后来，相同的方法被用于将质粒DNA (Cohen et al. 1972)和大肠杆菌染色体DNA(Oishi and Cosloy 1972)转化到细菌的实验中。

在1970年两位生物学家Morton Mandel和 Akiko Higa发现大肠杆菌细胞经CaCI2溶液处理时能够吸收入噬菌体DNA，细胞这种能够吸收DNA的状态便被称感受态。使用理化方法诱导细胞，改变细胞膜状态，增强细胞膜的通透性，细胞膜表面性状发生暂时性改变，方便外源基因或者载体进入受体细胞，这种处于最适合摄取和容纳外来 DNA状态的细胞被称为感受态细胞( competent cell)。由于细胞膜具有流动特性，细胞膜通透性随后会逐渐自动修复。其中转化 ( transformation)是指同源或异源的“裸露”分子被感受态细胞摄取并使其基因型和表现型发生相应变化的现象得到表达。采用Mandel和Higa的简单实用的步骤，通常可使每毫克超螺旋质粒DNA产生100~106个大肠杆菌转化菌落。

大肠杆菌感受态细胞制备法

在了解了相应的起源之后，感受态细胞的制备原理理解起来也就容易很多了。接下来以大肠杆菌感受态细胞为例进行学习，其中主要分为化学法与物理法两个大类。当可能得到的每一个克隆目标基因都非常重要的时候，能否具有更高的转化效率就尤为重要。

化学法制备大肠杆菌感受态细胞

1. CaCI2法

处于对数生长期的细菌经 CaCI2处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源 DNA的状态叫感受态。其制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存，因此CaCI2法使用非常广泛。

CaCI2法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的化学方法。此法操作简单，重复性好，但影响因素较多，若不注意细节和条件容易导致实验失败。

该实验的成功与否主要和培养时间和转速以及Ca2+终浓度和热激时间在内的等多种因素的相关。

星耀小TIP：大肠杆菌的转化效率受多种因素制约，其中一个因素是细菌细胞应处于对数生长早期，生长过度或发育不全的细菌制备感受态细胞转化效率较低。

2. 一步法

一步法也称TSS 法，较CaCl2法快捷简便﹐不需要热休克，更方便易行。

1989年CHUNG等研究报道，在原有的CaCl2法基础上进行改进:在LB培养液中加入1× TSS ( 10%PEG，5%DMSO，10%甘油，MgCl2,MgSO4）贮存溶液。冰浴后加入DMSO菌液可降低细胞毒性并延长感受状态。

研究发现使用TSS法制备大肠杆菌BL2l菌株感受态细胞的最优转化条件为:转化体系冰水浴30 min，再取出样品置于室温中放置10 min，加入适量新鲜LB华体会体育最新地址 后置于37 ℃、150 rmin摇床中振荡复苏40 min，涂布抗生素平板，最后37℃过夜培养筛选转化子。

3. 甘油-聚乙二醇法

甘油-聚乙二醇法(Glycerin-PEG，G-PEG)属于高效感受态细胞制备方法，利用化学试剂在低温下与细菌质膜的相互作用，增加膜表面通透性，降低外源基因进入细胞内部难度，在一定条件下使外源DNA进入受体细胞。G-PEG法比CaCl2法更容易在0℃低温下保存感受态细胞，相较于CaCl2法，G-PEG法存储液中多了甘油、葡萄糖保护剂，-30 ℃以下也可使感受态细胞保存至少180 d，其机制可能为含有少量水分的结晶化合物和部分胶态物质的结合可以对菌种产生更好的保护作用，PEG作为一种多糖类物质在促进细胞膜和质粒DNA结合的过程中发挥重要作用。

Rajagopal（Chennai Institute of Technology，金奈理工学院）等对一步法进行改进，使用含有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的缓冲液制备大肠杆菌感受态细胞，转化过程简单易行，且重复性高，含CTAB的缓冲液可以更有效摄取质粒DNA并连接反应产物。将细胞与1~～10 ug·mL-1CTAB混合，孵育，缓冲液洗涤，剩余未使用的感受态细胞可以冷冻在10%甘油中。转化时，将质粒DNA和细胞混合并在4℃下孵育5~60 min，此时孵育时间变化对后续过程影响不大，并且无需加热脉冲。1ug·mI-1的CTAB最适合转化且具有抗性，5～10 p·g·mI-1的CTAB会破坏大肠杆菌的细胞壁，细胞壁通透性越高，摄取DNA能力越强，该方法快速高效，可以产生105~10CFU·ug-1质粒 DNA。

物理法制备大肠杆菌感受态细胞

1. 电转化技术

电转化技术( electrotransformation technology)也被称为电穿孔技术，是利用电脉冲瞬时电击使细胞膜形成电穿孔，促进大分子或亲水性分子进入细胞的方法，最早用于将DNA导入真核细胞。该法效率高，结果稳定。

电转化技术可以满足构建大容量基因文库和抗体库的需要，瞬间电击脉冲可以使细胞表面出现暂时性小孔，电击作用使孔隙通道变大，促进细胞融合，方便外源DNA进入。但电转化技术受到诸多条件影响，如电场强度、脉冲时间、质粒 DNA，微生物的生长状态等。

其中感受态细胞生长状态影响表现在:早于或晚于对数生长期的细胞在进行电转化时转化效率均不理想，增加供体细胞数量也可以提高转化效率；OD600值维持在细胞对数生长早中期时最宜制备感受态细胞；对数生长晚期的细菌发生老化，随OD600值增加转化效率降低；电转化效率和质粒DNA含量在一定程度上成正比，过量或体积过大的质粒DNA不能提高转化效率。

电场强度的影响表现在:在DNA和细胞接受电脉冲的早期，两者由随机分布转为向阳极运动，而晚期的DNA则分布于细胞外膜或胞质间隙，DNA进入细胞胞浆则是在37℃孵育过程中，虽然高场强的电脉冲可以完成这个过程，但电荷累积到一定程度的低场强也可以使细胞膜表面形成孔道，但此状态下的细胞由于内含物质外流极易死亡，因此适当的脉冲强度可以在保证细胞状态良好的同时提高转化效率，否则过高的电场强度会使部分细胞在大量外源生物大分子物质涌入后由于不能承受过高的场强而破裂死亡，造成无效转化。

刘麒（吉林农业科技学院）等在研究大肠杆菌TG1对pDJ01质粒的电转化条件时摸索出最适电压为1800 V、电容25uF、电阻200 Ω，此时对细胞损伤最小，转化效率最高。4℃以下的低温环境收集感受态细胞和进行电穿孔有助于获得更高的转化效率，推测低温转化有助于维持细胞存活率，减少电击对细胞造成的热损伤。此外，低温下的细胞活性降低，对外界刺激的敏感性也随之降低，有利于细胞膜形成的孔隙开启时间延长，使更多的外源DNA进入。

2.超声波转化法

随着功率超声波设备的发展，依赖于声孔效应的超声波转化逐渐发展成为一种较理想的微生物转化技术。存在于液体中的微气核空化泡在声波的作用下振动，当声压达到一定值时会发生急剧崩溃，在强大的拉应力作用下将液体“撕开”成一空洞，这一过程称之为“超声波空化”。利用超声波技术可以使细胞膜和细胞壁表面产生许多可逆的空隙，瞬时破坏细胞膜后可以将药物或基因整合到活细胞中。

具体的超声波频率由Song等于2007年首次在低频波段超声波40kHz发现。Yang等在申报专利中报道多种革兰氏阳性菌混合菌群的转化实验，发现化合物的直径应小于75 nm，且化合物越小转化越容易。

耀海服务案例分享

结合基础理论分类，接下来就以耀海生物项目中使用的的大肠杆菌pKD46电转感受态细胞的制备来和大家一起具体学习实际操作中的细节。

耀海生物感受态细胞制备的工艺流程

1. 感受态细胞的制备

培养条件:

获得携带PKD46的菌株可以把PKD46质粒先转入想要做敲除的菌株中，比如大肠杆菌MG1655,大肠杆菌W3100等。

星耀小TIP：一定要特别注意携带PKD46质粒的菌株是在30℃的条件中培养，如果放到37℃的条件下培养，会导致PKD46质粒的丢失。

活化：

从-80℃冰箱拿出菌株，需要在固体平板上划线3次，充分活化携带PKD46的菌株。活化好的菌株，直接挑取单克隆到液体LB华体会体育最新地址 中摇瓶培养，不要放置到4℃冰箱中。等到第二天再挑到液体LB中，因为低温会导致菌株代谢活性下降。

OD：

整个感受态制备过程中，最关键的就是OD600，当OD600=0.2，加入0.2%-0.5% L-阿拉伯糖，诱导2h左右，等OD600=0.4-0.5，收集菌体，用10%甘油洗涤制备电转感受态。如果OD600超过0.5，会降低电转效率，要让菌株生长时相尽量处于对数生长期前期。加入阿拉伯糖的目的是诱导表达PKD46质粒上的三种蛋白，具体原理见大肠杆菌Red同源重组-原理。

2.大肠杆菌pKD46电转感受态细胞的转化

电转：

抗性片段电转的过程，只需要把抗性片段+PKD46电转感受态混匀，置于电转杯中，电转仪设置好参数，按电压2500 V、电阻200 Ω、电容25 µF的条件电击。

复苏：

电击完成后，迅速加入含有0.2%-0.5% L-阿拉伯糖的LB液体培养1ml，转移到15ml离心管中，置于30℃培养箱中复苏过夜，次日涂布到抗性平板上就可以。

培养：

涂布到抗性平板上以后，可以放置30℃继续培养或者置于37℃培养（此时PKD46诱导表达已经结束所以不会影响PKD46）

感受态细胞制备完成后，就可以进行基因敲除菌株的鉴定了。

3.基因敲除菌株的鉴定

鉴定引物设计:

鉴定引物设计的时候，一般都是选择在同源交换位点上下游100bp处。

结果确认:

根据野生型菌株和敲除菌株PCR得到的条带大小差异，基本可以确定敲除是否成功。也可把扩增得到的条带送去测序，根据测序结果最终确认，彻底消除疑虑。

4.抗性基因的消除

Pcp20质粒：

鉴定成功的敲除菌株，制备成电转感受态，转入氯霉素抗性Pcp20质粒。

消除抗性：

Pcp20质粒在30℃培养条件下可以表达翻转酶重组酶（flipase recombination enzyme, FLP）基因，使一个FRT位点和卡那霉素抗性基因消去。

消除Pcp20质粒：

把携带Pcp20质粒的敲除菌株在42℃和37℃培养，消除Pcp20，变成无抗性的敲除菌株

以上便是利用Red同源重组系统在大肠杆菌中敲除基因的详细操作流程。

关于大肠杆菌Red同源重组的内容到这里就告一段落了，希望对各位的学习和工作能有所帮助

参考文献：

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