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前言

为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

载体构建是分子生物学研究中最常用的实验技术，用于构建含外源DNA的质粒，酶切法构建载体是其中一种常用方法，传统的酶切连接方法依赖于 II 型限制性内切酶对 DNA 片段的特异性酶切及酶切片段与质粒载体的体外连接。但在实际操作中需要多步酶切/纯化，操作繁琐，耗时还较长，另外，将DNA片段克隆至载体时受酶切位点限制，一次只能将一个DNA片段构建进载体，长片段DNA的连接效率很低，克隆成功率也较低。

近年来，无缝克隆因其高效快速的优势逐渐取代传统酶连法在构建载体中的地位。无缝克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增，与常规PCR法是相同的（PCR相关知识点详见【星耀小课堂】PCR扩增技术原理，耀海生物在获取目的基因片段时就通常采用PCR扩增技术，以质粒为模板，以同源重组引物进行PCR扩增，设置成熟的扩增体系与条件，扩增产物再经琼脂糖凝胶电泳分离检测）。

唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化，这样基于DNA序列同源序列之间的重组，就可快速将多个片段定向克隆到任意线性化载体中。同源重组酶将载体和DNA片段的同源区域进行重组连接，得到无缺口的闭环质粒，直接转化感受态细胞筛选克隆，就无需考虑限制性内切酶的限制性因素，而且多片段可以同时定向重组插入载体及高通量的载体构建。

插入片段和载体之间既可以通过重组酶实现体外重组，如Gateway ® (Invitrogen) 15和 In-Fusion^TM(Clontech) ，也可以在大肠杆菌体内实现同源重组。大肠杆菌体内同源重组机制有3种：RecA 依赖性、RecA 非依赖性和Red/ET 依赖性，同源片段分别需要满足 >1 kb、>12 bp 和 30-50 bp。RecA 依赖机制要求的同源区域太长，不适合进行构建载体克隆。基于 5'-3' 外切核酸酶和单链 DNA 退火蛋白的 Red/ET 依赖性重组是一种有效的方法，但表达Redα/Redβ 或 RecE/RecT 蛋白又成了必要条件。另外，将 λ 噬菌体 Red 重组系统整合到大肠杆菌基因组中也可以实现高效率的同源重组，与Red重组相关知识点详见大肠杆菌Red同源重组原理。

尽管体外和体内同源重组方便，但需要昂贵的酶或特定菌株。受上述克隆方法的启发，2017年，国防科技大学张东裔和孟尔共同在Scientific Reports发表文章：OEPR Cloning: an Efficient and Seamless Cloning Strategy for Large- and Multi-Fragments。基于体外重叠PCR和体内同源重组，他们开发出一种DNA 长片段和同时组装多个 DNA 片段的高效克隆策略，称为“OEPR”(based on Overlap Extension PCR and Recombination in vivo)。OEPR 克隆是一种无缝的、不依赖于限制性内切酶和连接酶的方法。该方法利用重叠PCR和大肠杆菌体内的同源重组系统，可以轻松构建一个长片段 (1-6 kb) 或多个片段 (2-4 个片段) 定向克隆到质粒载体中。与其他构建方法相比，更高效、成本更低。

OEPR克隆步骤

图1左图展示了用OPER克隆方法插入单个DNA片段到质粒载体中，可以分为三个步骤：

1)使用带有突出端 A 和 B的引物（F1 和 R1）对目标插入片段 a 进行指数扩增（图 1A）。得到的 PCR 产物 (M1)包含与载体插入部分同源的区域 (突出端 A 和 B) (图 1A )。反向引物 R1 的 5' 端包含用于重叠延伸 PCR的同源臂（天蓝色部分 B，图 1A ）（Tm = 68-70°C）。正向引物 (F1) 的 5' 末端包含用于体内的同源区域（橙色部分 A）。

2)PCR 产物(M1)与短反向引物 (R) 一起使用，扩增目标质粒。在两轮PCR之后产生了包含同源区域A（橙色）的PCR终产物。

3)第二轮PCR的产物用DpnI消化，然后直接转化到感受态大肠杆菌细胞中，通过大肠杆菌体内的同源重组机制在体内修复突出端（同源区域 A ）。

4)对于多片段克隆来说，如图1右图所示，只需要分别克隆出多个DNA片段，再通过Overlap PCR便可将多个DNA片段与载体连接，通过短的反向PCR一起扩增出含有同源区域A的PCR终产物。

图1：基于体外Overlap PCR和体内同源重组修复的OEPR克隆方法

同源臂对OEPR 克隆效率的影响

首先，研究人员测试了末端同源臂A的长度（图 1）对 OEPR 克隆效率的影响。使用一系列含有不同长度（5 -35 bp）的 5' 同源臂A 的F1 引物将 1 kb DNA片段插入到pGADT 7（7988 bp），转化大肠杆菌。如图2，结果发现，使用＞ 15 bp的同源臂A获得的重组菌落更多（>300），阳性克隆效率也更高（>90%）。有趣的是，与其他同源臂A长度相比，15 bp 同源臂产生的阳性率最高（100%）。

图2：不同长度的同源臂A对OEPR 克隆效率的影响。A:使用携带不同长度的同源臂A的F1/R1扩增出的1kb靶标DNA片段。B:将D第一轮PCR产物与短反向引物R一起来扩增pGADT7质粒。C：不同长度的同源臂A组转化后的克隆子数目。D:不同长度的同源臂A组转化后的阳性率

不同长度DNA片段对OEPR 克隆效率的影响

研究者使用15 bp或 30 bp的同源臂A引物，研究不同长度的DNA片段对于OEPR 克隆效率的影响，每种DNA片段均被插入到pGADT 7（7988 bp）质粒载体中。在第二轮PCR中，使用更多的插入片段，转化后将会获得更多的克隆子数。如图3C和3D所示，对于 1 kb 和 2 kb 的插入片段，携带15 bp 同源臂A往往比 30 bp 同源臂A产生更多的转化克隆子数目和转化阳性率。对于＞2 kb (3 kb~6 kb) 的插入片段，效果相反。总的来说，如图3E所示，增加插入DNA片段的长度会降低转化后的克隆子数量和克隆阳性率，但这种下降也是可以通过使用更长的同源臂来弥补的。

图3：不同长度DNA片段对OEPR 克隆效率的影响。A：携带15bp同源臂A的质粒扩增产物；B携带30bp同源臂B的质粒扩增产物；C：携带15bp同源臂A的不同DNA片段的不同剂量对于克隆子数目的影响；D：携带30bp同源臂A的不同DNA片段的不同剂量对于克隆子数目的影响；E:携带15bp/30bp同源臂A的不同DNA片段的克隆阳性率差异

插入多个片段:

以上数据说明，OEPR 克隆是一种将大片段插入质粒载体的有效且精确的方法。为了将 OEPR 克隆方法开发为更强大的分子克隆工具，研究者测试多个 DNA 片段是否可以使用 OEPR 克隆方法同时连接到同一质粒载体上面。结果发现，对于不同长度的插入片段（将两个1 kb、两个2 kb、两个3 kb、三个1 kb、三个2 kb和四个1 kb片段），OEPR 克隆方法可以很好的完成这些多片段的同时组装。

具体来说，在第一轮PCR反应里，所有靶标DNA片段均得到扩增，完成纯化回收。片段 a (500 ng) 和其他片段 (每个 100 ng) 分别作为正向引物和模板添加到第二个 PCR反应中。反应完成之后，通过琼脂糖凝胶电泳检测到含有所需同源区域的最终 PCR 产物（图 4）。结果表明，30 bp 的同源臂比15 bp 的同源臂产生更多的重组菌落（图4）。从转化后克隆阳性率来看，15 bp 同源臂更适合组装较短和/或简单的片段（两个 1 kb 和三个 1 kb 片段），而30 bp 同源臂更适合组装较长片段。

图4：用于组装多个DNA 片段的 OEPR 克隆。A/B: 携带15bp/30bp同源臂A 的不同大小的多个DNA片段（两个 1 kb、两个 2 kb、两个 3 kb、三个 1 kb、三个 2 kb 和四个 1 kb（分别为泳道1-6））经过第二轮PCR的终产物，白色箭头表示最终产物的目标条带；C:确定每个平板的菌落数，以估计插入具有 15 bp 和 30 bp 同源臂的多个片段的克隆效率；D: 通过菌落 PCR 确定多片段DNA组装的阳性克隆百分比

结论

载体构建是基因工程、蛋白质工程、测序技术等领域内的关键基础工具。随着测序技术的发展，通过构建特定载体来研究细胞内部各种蛋白的生理功能显得极为重要。随着高保真DNA聚合酶和 PCR技术的提高，很多基于大引物和PCR的无缝克隆方法陆续涌现，极大地改善了载体构建的效率。本文提到的OEPR 就是是一种低成本、高效率、节省时间的新型载体构建方法，最为显著的特点是将重叠PCR和重组酶相结合，并且实现了非常高的克隆效率OEPR载体构建策略既可以在载体上插入较长的单DNA片段，也可以同时组装插入多个DNA片段。总之，对于进行基于质粒遗传操作（如基因突变、基因嵌合和基因融合）的研究人员来说，OEPR 克隆是一个不错的选择。

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