前言

在上一篇文章中，菌菌带领大家大致了解了重组蛋白菌种建库的主要内容和大致流程，详情可参考江苏耀海生物制药有限公司的公众号文章《【星耀避坑攻略】重组蛋白生产菌种株建库》。

目前互联网上关于细胞建库的内容并不是很多，有需要的小伙伴想了解真核细胞建库和原核细胞建库的差异不太容易查到相关文章。菌菌在请教了耀海的老师们后为大家浅显的浅述一下：

目前，针对真核细胞和原核细胞的细胞建库命名和构建流程都大致相同，均是从RCB（Research Cell Bank，研究细胞库）建库到MCB（Master Cell Bank，主细胞库）建库再到WCB（Working Cell Bank，工作细胞库）建库。原核细胞与真核细胞的建库差异主要为构建方式的不同。接下来菌菌带领大家详细了解原核细胞建库的主要内容。

原核细胞库

在原核细胞库构建之前，我们需要明确细胞库构建的目的，确定实验目的后即可开始RCB菌株细胞的构建，并对RCB细胞菌株进行表达水平验证，察看其各项指标是否均满足质量标准，为后续MCB细胞库和WCB细胞库的建立奠定基础。细胞库系统通常包括主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）。主细胞库是由含目的基因表达载体转化的细胞种子经传代扩增制成的均一悬液，分装于单独容器中用于贮存。工作细胞库是从主细胞库经有限传代扩增制成的均一悬液，并分装于单独容器中用于贮存。所有的贮藏容器应在相同条件下妥善保管，一旦取出使用，不得再返回库内保存。

星耀小TIP：应详细记录细胞库类型、容量、预期使用频率下的寿命、保存容器、冻存剂、华体会体育最新地址 、冷冻保存步骤和贮存条件等信息，并提供库存细胞稳定性的证据。

构建流程

在原核细胞库的构建中，最重要的部分即是RCB细胞库的构建。RCB建库的法规要求“建立RCB需保证可溯源性，GMP体系下生产对RCB来说为非必须条件”。在此菌菌跟大家重点科普一下RCB细胞库的构建流程。首先我们需要将想要的质粒DNA通过PCR实验进行扩增，再利用酶切连接构建到载体中，得到重组质粒，经过酶切验证、PCR验证、测序验证以及蛋白表达准确无误后，确认质粒构建成功。

图1 质粒构建流程图

大肠杆菌感受态细胞的制备在耀海生物公众号耀海人才的文章《【菌周刊】大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备》和《【菌周刊】大肠杆菌Red同源重组敲除—感受态细胞的制备》，均有具体实验流程可供参考，如下图所示。

图2 CaCl2法制备感受态细胞

星耀小TIP：CaCl2法所制备的大肠杆菌感受态细胞，往往对于温度和保存时间有较高的要求，转化率也受到诸多因素影响。因此，在实际实验中需要对新鲜处理的感受态细胞进行复杂的甘油、液氮处理及超低温保存，过多的样品处理环节就需要购置昂贵的超低温设备，增加实验成本，延迟操作时间，也会增加转化污染的可能。

将质粒基因和感受态细胞转化入宿主细胞中，尔后从原始菌株中筛选出优势菌株的宿主甘油菌，以一定比例接种于含抗生素的华体会体育最新地址 中，进行菌株筛选和扩增培养，常用的方式为平板划线法，然后得到长势良好的优势菌株进行甘油分装并保藏，一般会建立50-100支菌株作为RCB细胞库，同时进行表达水平验证，以确保RCB中的优势菌株符合实验要求。得到的菌种液根据实验目的来获取上清液或者沉淀，当所得的菌株发酵液为上清液时，可使用AKTA层析系统采用亲和层析、分子筛层析、离子交换层析等层析方式得到目的菌株并交付样品。

图3 RCB菌株库流程图

MCB和WCB可参考《中国药典》2020年版三部：MCB细胞库需取RCB库中的菌种通过规定的方式传代增殖后，在特定倍增水平或传代水平同次均匀地混合成一批，定量分装，保存于-60 ℃及以下的环境中。这些菌种须按其特定的质控要求进行全面检定，全部合格后即可作为主细胞库，供建立工作细胞库用。
WCB（Working Cell Bank，工作细胞库），经主细胞库菌种传代增殖，达到一定代次水平的菌种，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的菌种冻存管，在-60 °C及以下的甘油管中保存备用，即为工作细胞库。

星耀小TIP：依据《中国药典》2020年版三部法规有：生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次，工作细胞库必须限定为一个细胞代次。MCB和WCB必须在GMP车间内完成。

总结

今天菌菌的科普与分享就到这里啦！菌菌再带领大家回忆一下，真核细胞与原核细胞建库流程的差异主要是构建方式的不同，原核细胞的建库主要是构建好的质粒基因和感受态细胞一同转化入宿主细胞（常用大肠杆菌）中。原核细胞建库中最重要的是RCB建库，RCB细胞库的稳定性为后续MCB细胞库和WCB细胞库的建立奠定基础。在下一篇文章，菌菌将会带领大家了解重组蛋白生产菌株建库的稳定性，欢迎大家踊跃探讨。

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