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导读： 本文主要内容为大肠杆菌自溶的机制，大肠杆菌衰亡的研究历史，发酵中大肠杆菌自溶的现象，噬菌体引起大肠杆菌自溶的因素，非噬菌体引起大肠杆菌自溶的因素，大肠杆菌工业化生产的基本形式等。

前言

大肠杆菌是目前在实验室端以及大规模工业生产端最常使用的基因工程菌种。经过多年的选育和研究大肠杆菌在载体构建、宿主选择和目的基因克隆方面已经取得了长足的进步并形成了非常成熟的技术方案，但在大规模工业化生产阶段还是存在诸多问题，如：高密度发酵过程中存在的自溶问题一直困扰着技术人员。

目前公认的高密度发酵过程中的自溶原因是 噬菌体 的存在，其他也有少数非噬菌体引起的自溶现象的出现。

如何破解大肠杆菌自溶的难题已经成为阻拦在大肠杆菌大规模生产道路上的重要问题。接下来菌菌就和大家一起一探大肠杆菌菌体自溶的奥秘。

一、什么是大肠杆菌的自溶？

在高密度发酵过程中常常出现大肠杆菌菌体自行死亡并破裂的的现象，导致菌种整体生长速度过慢以及菌种发酵量的不足，影响项目进程。目前发现的主要的菌种自溶因素是噬菌体的存在以及其他非噬菌体的原因。

既然提到了噬菌体，那么就不得不提一下噬菌体的导致菌种破裂的原因。

噬菌体 主要通过寄生于菌体中并依靠菌种自身的合成途径合成自带噬菌体或依靠本身的分裂增殖途径利用菌体的合成组分进行增殖。 待繁殖噬菌体的成熟后压迫菌体导致其破裂释放更多噬菌体并重复上述过程。

鉴于其惊人的增殖速度以及噬菌体本身简单结构带来的超强存活性，所以一旦发生噬菌体感染，务必停止产线运行进行彻底消杀并将产线暂存15日以上，确保彻底消灭噬菌体避免其扩散。

菌菌整理了目前主流的 噬菌体消杀方案以及预防措施 ，如有需要，私信联系。

其他非噬菌体原因：

（1）代谢产物

在代谢产物导致菌体破裂的情况中较为常见的是 多粘菌素

经研究发现，在大肠杆菌自溶的因素的中多粘菌素B Sub-MICs可随着时间的延长导致细菌淡染程度加重、活菌数量减少、电镜下细菌胞壁缺损甚至破坏，内容物完全或部分丧失。

（2）外源蛋白表达与大肠杆菌菌体自身的胁迫应激机制

经研究，在生物反应器中培养大肠杆菌时发现，高表达的外源蛋白迅速生产并积累在细胞内，导致菌体的正常生理活动受限并不能正常吸收华体会体育最新地址的中的营养成分导致菌体不能维持而破裂。

（3）接种量与补料速度

研究发现谷氨酸氧化酶在使用大肠杆菌体系进行大规模发酵时，若接种量大于2%就可能会出现对大肠杆菌发酵产生不利影响，并导致发酵结束时菌种数降低。若接种量大于5%发酵液中的菌种基本就会全部自溶。

出现接种量导致菌体自溶的原因，可以理解为因为菌体的初始数量较大导致菌体在培养初期即出现菌体数量过多而导致菌种华体会体育最新地址营养不足而导致的菌种死亡。

补料速度也是大肠杆菌自溶的主要因素之一。 其导致菌体自溶的主要原因是补料速度过快导致菌体生长过快从而导致在相应时间段内添加的补料不足以支持其在该时间按段内的生长，从而导致菌体营养不足，导致菌体逐渐自溶。

（4）华体会体育最新地址中碳源不足

华体会体育最新地址中碳源不足会导致菌体的骨架合成能力不足以满足菌体的快速增殖，导致菌体在生长期因骨架不足而死亡。

（5）其他会导致菌体自溶的原因 ，主要是PH值、温度以及溶氧量等原因。

二、大肠杆菌自溶的研究历史

早在大肠杆菌被广泛使用之前人们就已经观察到细菌菌体的死亡和自溶现象并对此加以研究。

（1）19世纪早期研究人员将细菌生命周期中最后的自我降解过程定义为自溶

（2）19世纪中期研究者们认为细菌培养条件可以诱导细菌自我降解的发生，如：高温、溶氧量过高、CN源不足、PH、渗透压。

（3）目前，对于自溶的观念的改变已经转向认为自溶是类似于真核组织细胞凋零的 程序性死亡机制调控 。

最新研究表明大肠杆菌内存在类似于真核组织细胞凋零的程序性死亡机制，并以此机制作为影响大肠杆菌自溶的调控因素。

大肠杆菌的类似程序性死亡机制被认为具有调控细胞在营养物质缺乏和生存环境恶劣的情况下的一种生存策略，主要用于去除 活着但是不可培养 的细胞，以保证其他细胞有足够的生存环境。

此处所指的不可培养的细胞是指在发酵过程中由于营养缺乏或环境刺激而由活细胞转化成的，牺牲部分以保全菌种的延续。

其主要的自溶途径是当细胞受到pH、氧化(Oxidative stress)、温度(Heat shock)和营养物匮乏(Nutrient starvation)等环境胁迫时，未折叠好的周质蛋白在周质空间或细胞膜上积累诱发介导的自溶机制启动， σE蛋白在细胞质内被激活；假如损伤蛋白积累的量小，则被激活的蛋白水平也会较低，细胞则启动与蛋白修复相关的有关蛋白组的表达；如果损伤蛋白积累的量高到一定程度，那么活性σE的水平也会较高，细胞就启动σE的调节子sRNA-MicA和RybB的基因转录，然后通过这两个sRNA与同源mRNA的相互影响以及核糖核酸酶的降解作用降低OmpA.OmpC和OmpW等外膜蛋白的mRNA水平，进而减少这三个膜蛋白的表达，导致外膜缺陷，引起细胞的自溶。

在E. coli细胞中σ^E介导的细胞自溶模型

三、工业化高密度大肠杆菌发酵过程中菌体自溶的现象

发酵过程中如出现泡沫形成，且暂停搅拌或加入消泡剂仍无法使泡沫消除，并且同时出现OD之快速下降（出现此种现象代表着菌种数量快速下降）、PH值上升（菌体破裂，体内碱性物质外漏，产酸能力下降）、溶氧上升（菌体数量减少导致氧气消耗量减少）、发酵液拉丝（菌体破裂物质泄漏，发酵液粘度增高）、镜检可见碎片、发酵液味道异常。

TIP： 自溶现象对后续步骤的影响

1.细胞溶解会释放胞内蛋白酶到培养液中，影响后续菌种的繁殖

2.菌体破裂核酸分子外漏导致发酵液粘度增高，增加后续超滤和分离层析额难度

3.菌体自溶会导致目标蛋白的整体表达效率降低，进而影响生产率。

耀海生物深耕大肠杆菌体系多年曾多次成功地为友商及客户提供大肠杆菌自溶现象分析服务以及处理方案设计。如有大肠杆菌自溶问题服务需求，欢迎随时咨询。

四、如何避免菌体自溶现象的出现

1.做噬菌斑实验或电镜观察

对发酵过程的每一环节进行噬菌斑测试或电镜观察，寻找感染噬菌体的环节。

若是菌种感染噬菌体则需将原始菌种重新接种培养，继续进行；

若是培养感染噬菌体，则只需更换新的华体会体育最新地址；

若是发酵罐及其部件感染噬菌体，则需更换发酵罐并对环境进行全面消杀

2.若是由于华体会体育最新地址中的碳氮源比例不合适而导致的自溶，则需调整华体会体育最新地址培养并进行优化；