双特异性抗体( bispecific antibody，BsAb) 是一类具有两种不同抗原结合臂的抗体，由两个不同的轻链和重链组成，可同时结合两种不同的抗原。自20世纪60年代双特异性抗体的概念被Nisonoff等首次提出以后，由于其独特的结构特异性和显著的肿瘤治疗效果，双特异性抗体迅速成为免疫治疗领域的热门研究项目。近些年来，随着技术不断发展，双特异性抗体的构建方式和纯化方法也在不断地进步与创新。该文将对双特异性抗体的作用机制及制备与纯化方法进行简要综述。

双特异性抗体是一种能同时结合两种不同抗原的特异性抗体，在自然界并不存在，仅可通过基因工程、细胞融合等技术人工合成。自20世纪80年代被首次应用于肿瘤治疗后，因其独特的作用机制和显著的效果，迅速引起了学界关注。与传统单抗相比，双特异性抗体具有以下优势:①可减少药物开发和临床试验成本。②双特异性抗体的治疗效果明显优于两种或多种单抗联合应用。双特异性抗体可使靶细胞表面受体形成网状连接，进而形成受体聚集物，从而提高抗体对肿瘤细胞的抑制作用，并且对传统单抗难以起效的低表达细胞亦有显著效果。③相对于多种单抗联合应用，双特异性抗体的副作用较小。例如，CD47单抗易结合红细胞和血小板，造成贫血，而CD47－PDL1双特异性抗体的CD47端与PDL1端均与肿瘤细胞结合，其中PDL1端起牵引作用，有效减少抗体的副作用。由于以上这些优点，双特异性抗体也被誉为“下一代抗体”。目前已有3种双特异性抗体分别在欧洲和美国获批上市，2017 年，中国自主研发的“注射用重组抗HER2 和CD3人源化双特异性抗体”获批进入临床试验阶段，2019年该抗体获得美国食品药物管理局( FDA) 批准在美开展临床试验。近年，已有多篇中英文文献介绍了双特异性抗体的作用机制、结构以及癌症治疗中的研究进展，但缺乏对双特异性抗体治疗其它疾病以及下游纯化工艺的相关介绍，本文结合最新的研究进展，对双特异性抗体的作用机制、制备与纯化方法进行简要得概述。

一、双特异性抗体的作用机制

双特异性抗体因具有2条不同的抗原结合臂，可同时结合两个不同的抗原或抗原表位，具有单克隆抗体难以比拟的结构优势。双特异性抗体在体内的具体作用机制仍未完全被掌握，但根据两条抗原臂结合的目标不同，可将双特异性抗体大致分为以下3种: ①介导免疫细胞与肿瘤细胞结合; ②同时阻断多个肿瘤信号通路; ③形成抗体－药物复合物。截至2017年底，已有57种双特异性抗体获批进入临床试验阶段。其中38种是通过介导免疫细胞与肿瘤细胞相结合而发挥作用的。剩余的19种双特异性抗体中，另有14种是通过阻断肿瘤的信号通路，5种是通过向肿瘤传递载荷药物来发挥作用。

1、 介导特异性免疫细胞与肿瘤细胞结合

双特异性抗体的两条抗原结合臂，其中一条与其靶向的肿瘤细胞抗原相结合，另一条与免疫效应细胞上的抗原结合，后者可以激活免疫效应细胞，使其定向的杀伤肿瘤细胞。T细胞作为最重要的免疫细胞之一，在体内发挥细胞免疫、免疫调节等作用，是双特异性抗体所介导的最重要的免疫细胞。目前已经获批上市的两种针对肿瘤的双特异性抗体卡妥索(Catumaxomab) 和博纳吐(Blinatumomab) 均是通过与T细胞表面的CD3受体结合，使T细胞靶向杀伤肿瘤细胞。卡妥索作为全球首个双特异性抗体药物，其两个抗原结合臂可以分别与T 细胞上的CD3 抗原和上皮细胞粘附分子( EpCAM) 相结合，其适应症并非靶向癌症，而是肿瘤导致的恶性腹水。但是近期也有实验表明，通过与活化T细胞结合，卡妥索可以在体外杀灭耐药三阴性乳腺癌细胞。此外，卡妥索还可通过Fc片段与Fcγ受体结合，来激活巨噬细胞，树突状细胞和NT细胞等其它免疫细胞。博纳吐是2014 年获FDA批准上市的另一种双特异性抗体，它是一种CD19 /CD3 抗体，CD19会在恶性B细胞中大量表达，博纳吐可针对性介导T细胞靶向攻击病变的B细胞，主要用于复发与难治性费城染色体阴性B 细胞前体急性淋巴性白血病(BCP－ALL) 。2018年，FDA 扩大了博纳吐的适应症，允许其用于其它B细胞前体急性淋巴性白血病。除了介导T细胞靶向杀伤肿瘤细胞，双特异性抗体还可通过Fc段与NK细胞或巨噬细胞表面的FcR 结合，使其靶向与Fab段结合的肿瘤细胞，发挥ADCC效应( 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用) 。如特异性识别间皮素/CD16的MesobsFab抗体，由于间皮素是一种由糖基－磷脂酰肌醇组成的膜蛋白，在三阴性乳腺癌细胞( TNBC)中呈高水平表达，MesobsFab可介导NK细胞靶向TNBC。双特异性抗体还可以结合病毒表面的受体，使免疫细胞靶向病毒感染的细胞，如bsHN－CD16抗体可以识别新城疫病毒( NDV)囊膜表面凸起的结构糖蛋白血凝素－神经氨酸酶(HN)和CD16，从而介导NK细胞杀伤NDV感染的细胞。

2、阻断信号通路

肿瘤的发生与发展过程中往往涉及到许多的信号通路，因此阻断肿瘤的信号通路是肿瘤治疗最有效的方式之一。双特异性抗体的另一个重要机制就是它能同时结合两个靶点，阻断肿瘤中两条不同的的信号通路，从而达到更好的抑制肿瘤的作用，同时还可避免肿瘤细胞对治疗性抗体产生耐药性。根据抗体结合的配体不同，可分为肿瘤表面受体、炎症相关因子、血管生成相关因子以及死亡受体( DR) 等类型。

人表皮生长因子受体( HER) 是细胞内负责接收生长因子的受体，具有与胞外配体结合和传导信号进入胞内，并激活细胞内信号通路的功能。肿瘤细胞表面的HER家族受体往往呈高表达，因此靶向HER是一些实体瘤的有效治疗方法。度戈妥珠( Duligotuzumab)就是一种可结合EGFR/HER的抗体，可用于治疗RAS野生型转移性结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌。亦有研究表明度戈妥珠对已产生耐药性的肿瘤也有一定作用。

肿瘤血管是肿瘤细胞的营养通道和转移途径。想要切实有效地抑制肿瘤生长，阻止其转移，最有效的办法就是阻断肿瘤的血管生成。VEGF－A、Ang－2等血管生成因子在肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用。Vanucizumab 作为一种可同时识别并阻断VEGF－A 和Ang－2 的双特异性抗体，可显著抑制肿瘤新生血管形成，可用于治疗难治性实体瘤。而抗VEGF－A/Ang－2的新型纳米抗体BI836880除抑制肿瘤血管生成外，还具有抑制肿瘤细胞转移的潜力。

DR是一种细胞表面的肿瘤坏死因子受体，它们与相应的配体结合后，可以通过一系列的信号转导过程，最终激活caspase家族蛋白，剪切相应底物，使肿瘤细胞凋亡。RG7386可同时针对肿瘤中的成纤维细胞活化蛋白( FAP) 和肿瘤细胞表面的DR5，使FAP和DR5结合、聚集，诱导肿瘤细胞凋亡，在临床试验中经注射RG7386的FAP阳性实体瘤患者体内肿瘤显著减小。

除了抑制肿瘤，双特异性抗体也可用于治疗自身免疫性疾病。在自身免疫性疾病中，多种细胞炎症因子及其在免疫细胞上的受体共同组成一个高度复杂的网络，它们共同驱动了体内的炎症反应。双特异性抗体可通过结合两个不同的炎症相关因子，阻断其相关通路，近年来被开发用于治疗自身免疫性疾病。罗米昔( Romilkimab) 是一种可识别IL－4和IL－13 的双特异性免疫球蛋白－G4抗体，可用于治疗肺纤维化及系统性硬化症。Lutikizumab(ABT－981) 能同时结合和抑制IL－1α 和IL－1β，可用于治疗类风湿性关节炎，减轻患者疼痛和功能障碍。

3、抗体－药物复合体

双特异性抗体的第三种机制是形成抗体－药物复合物，即抗体的一条臂与细胞表面抗原结合，另一条臂与载荷药物( 如放射性物质、螯合剂、脂类、肽及蛋白质等) 结合，从而将药物递送入目标细胞，达到靶向治疗的目的。多种放射性物质与抗体的复合物目前已进入临床试验阶段。替伊莫( Yttrium 90－ibritumomab－tiuxetan) 是通过FDA批准的第一种放射性免疫治疗剂。它由单克隆抗体ibritumomab、连接螯合剂tiuxetan和放射性标记同位素钇－ 90组成，其中ibritumomab可与CD20抗原特异性结合，故替伊莫可用于治疗复发性或难治性的非霍奇金淋巴瘤。但因其易与血小板结合，常见血小板减少、贫血等副作用。布仑妥昔－维多汀( brentuximab－vedotin) 是第一种被批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和全身间变性大细胞淋巴瘤的药物抗体复合物，可通过识别肿瘤表面的CD30抗原，实现药物的靶向投放。尽管布仑妥昔－ 维多汀在复发/难治性霍奇金淋巴瘤中有效率可达75%，五年生存率在90%以上，但大多数对其有反应的患者最终都会对其失去敏感性。这也揭示抗体－药物复合物与传统药物一样，在长期使用后均会产生耐药性。

二、 双特异性抗体的制备及纯化

与天然抗体一样，双特异性抗体是由2条重链(H) 和2 条轻链(L) 组成，呈Y字形，与天然抗体不同的是，双特异性抗体的两条重链与轻链来源不同，故可拥有两种不同的Fab和Fc 结构域，具有天然抗体难以比拟的结构优势。但也由于2对轻－重链组合来源的不同，在设计制备双特异性抗体时，需注意保持每个单克隆抗体各自结合域的独立性，从而确保2对轻－重链结合在一起时不会产生空间位阻。目前常用的抗体制备方法包括化学偶联、杂交瘤法和基因工程法，但是无论是哪种方法都难以解决由于无意义组装( 重链同源二聚体、非同源轻重链结合等) 导致的产率低、难纯化的问题。随着双特异性抗体的发展和应用，如何将所需的异二聚体从同二聚体和其它副产物中纯化出来，成为双特异性抗体药物生产过程中所必须解决的关键性问题。目前的双特异性抗体生产中主要应用离子交换色谱法，分离效果差，且需要前期改造，并不适合大规模生产。因此需要探索新的双特异性抗体纯化方法。

1、 双特异性抗体的制备

在过去的15年中，许多大型医药企业及生物制药公司已开发出超过60种双特异性抗体制备技术平台。如Genentech公司的Knobs－in－holes( KiH) 技术、罗氏公司开发的CrossMAb技术、Micromet公司的BiTE技术等。随着这些技术的出现，不仅解决了轻－重链错配问题，也使双特异性抗体的设计开发更加简便，结构也更加稳定，具有更好的疗效和稳定性。尽管双特异性抗体的制备技术繁复多样，从制备原理上仍然可将简单其分为三类: 化学偶联、构建双杂交瘤细胞系和基因工程法。

①化学偶联法：化学偶联是最早应用于制备双特异性抗体的技术。1985年，Brennan首次利用两个单克隆抗体G1片段的化学结合来制备双特异性抗体。化学偶联法主要有两种方式，一是将两种单抗抗体或其衍生物直接偶联形成双特异性抗体，二是先通过各种理化方式先将两种单抗解离成游离的轻链和重链，再将这些轻链和重链重新组合。化学偶联法的优点是快速，操作简便，回收率高，但也容易破坏抗体的抗原结合域，影响抗体活性，且容易形成多聚体。此外，在抗体生产过程中需使用交联剂，故通过化学偶联法制备的双特异性抗体可能存在致癌性，并不能用作治疗用途，只能用于免疫学检测。由于以上缺点，目前化学偶联技术在制备双特异性抗体方面并没有得到广泛的应用。

②双杂交瘤细胞系：利用杂交瘤细胞系来制备双特异性抗体，是指通过细胞融合技术，将两种不同的杂交瘤细胞系进行融合，再对可产生具有特定治疗性抗体的细胞进行鉴定和分离。因为两种杂交瘤细胞可以产生两种不同的轻－重链，而这些轻－重链可以随机组合，故用此方法制备的双特异性抗体具有较大的随机性，制备效率低。但杂交瘤细胞产生的抗体也具有生物活性好、结构稳定等优点。随着技术的发展，KiH、CrossMab等技术可以有效地解决异源抗体轻－重链的正确结合问题。

③基因工程法：通过基因工程技术重组蛋白，目前也被用于制备多种双特异性抗体。利用基因工程来编辑重组抗体，可以通过多种方式限制两对轻－重链结合的选择性来解决随机组合的问题。例如，BiTE(双特异性T细胞接合蛋白) 技术就是通过一个甘氨酸－丝氨酸连接来串联可结合T细胞的scFv和可结合肿瘤抗原的scFv，从而避免了轻－重链的随机结合。目前已获FDA 批准上市用于治疗白血病的博纳吐即是基于这一技术开发的。利用化学偶联和双杂交瘤细胞系制备的双特异性抗体，其免疫原性部分多为鼠源，故免疫原性强，且不易纯化，极大限制了双特异性抗体的临床应用。而基因工程法设计的重组蛋白可以有目的地人工改变抗体结构，将鼠源部分替换为人源，大大降低了免疫原性。因此，基因工程法是目前制备双特异性抗体最常用的技术。

2、双特异性抗体的纯化

由于亲本单抗的等电点和疏水性一般具有较大差异，故两者结合所产生的各种同二聚体、异二聚体等产物都具有不同的等电点和疏水性，可以使用离子交换、疏水交换、羟基磷灰石吸附等方式进行分离与纯化。尽管这些层析方法都具有一定的分辨率，但将所需的正确匹配的异二聚体从众多杂质中分离出来并不容易，需要在产率和纯度之间进行平衡。近年来，通过基因工程技术，改变双特异性抗体对蛋白A(PA) 、蛋白G( PG)的亲和力，但不影响对FcR的作用，使得通过亲和层析纯化双特异性抗体成为可能，大大增加了纯化速度和效率，为未来大规模生产纯化打开新思路。

①pH梯度蛋白质分离技术：传统的离子交换色谱( IEC)可以利用重链pI的巨大差异，将同二聚体和异二聚体分离开来，但是这种方法需要前期通过等电点工程定向改造双特异性抗体，而且依赖在较宽的pH范围内具有可控性的线性pH梯度。产生离子梯度的方法分为内部法和外部法。内部法是通过使用流动相滴定具有内在缓冲容量的弱离子交换树脂来产生外部的pH梯度。外部法的pH梯度是通过混合流动相与滴定剂，在进入洗脱柱之前就已经在外部产生。pH梯度的主要技术难点就在于可控制性。Krner和Hubbuch利用硅缓冲液优化法，成功研发出一种具有长程pH梯度且易于控制的离子交换色谱缓冲液系统。这种方法克服了传统IEC需要依赖计算机算法去控制pH梯度的缺点，操作更加简单，易于应用。并且这种方法的分离效果好，可以分辨出pI差距仅有0.1个pH单位的同二聚体和异二聚体。

②轻链/重链改造：两个来自于不同亲代单抗的轻链和重链随机组合，共有16种不同的组合方式，所需的双特异性抗体只是其中一种组合。因此，如何提高轻－重链正确配对，成为解决双特异性抗体生产和纯化的关键。KiH和CrossMab是目前被应用于改善轻－重链配对问题的两种常用技术。

KiH技术即在CH3结构域引入不对称的突变结构( “knob”突变指在CH3 结构域中，用一个大的氨基酸残基替换一个较小的残基，而“hole”突变指使用小的氨基酸残基来替换较大的残基) 。经过改造的双特异性抗体的Fc结构域由于空间位阻的影响更倾向于发生异二聚化而不是同二聚化。通过使用无细胞表达系统( Xpress－CF)，可以实现包括异二聚体两个可变区均进行KiH改造和同一抗原臂可变区进行串联非对称BiTE－KiH改造在内的多种抗体结构改造。而调节knob和hole的比例以及在结构中预装knob和hole，可进一步提高整个结构中KiH 的产率。而在糖基化的CH3结构域中引入一个Y349C突变，可以使糖基化重链间形成二硫键，增强KiH的稳定性。尽管KiH可以在一定程度上提高异二聚体的比例，但是仍无法完全消除同源二聚体，hole突变体中同源二聚化时有发生，hole－hole同源二聚体可达到总产出的5%。

而CrossMab技术是Roche公司基于KiH技术基础上开发的一种新的抗体配对技术，通过将双特异性抗体的一条Fab的轻链与重链进行结构域交换，而另一条不交换。交换后的轻链中会含有一部分同源重链的片段，使其不能与未经交换的重链配对，从而确保了轻链与重链之间的正确组合。CrossMab技术不仅可以促进重链的异二聚化，还解决了轻链与重链的配对问题。CrossMab可以分为仅交换Fab可变区、仅交换恒定区和交换整个Fab区三种，其中交换可变区和整个Fab时，会导致非目标异二聚体等副产物产率上升，纯化难度加大。Cross-Mab 技术应用于生产时，可通过CHO细胞系建立成熟稳定的表达体系，产生的双特异性抗体无论从产率、结构、稳定性上都可以与天然IgG抗体媲美。基于CrossMab技术开发的RG7221 ( Ang－2 /VEGF－A) 、RG7386( FAP /DR5) 、RG7716( Ang－2 /VEGF－A) 、RG7802( CEA/CD3) 等药物均已进入临床试验阶段。

③亲和层析法：双特异性抗体和天然单抗一样，都具有Protein A、ProteinG亲和力，无法将所需的目的异二聚体与非目标异二聚体、同二聚体等杂质分离，所以作为传统抗体生产中最行之有效的亲和层析无法应用于双特异性抗体的纯化。而通过基因工程技术，针对性的对IgG类双特异性抗体的Fc区进行突变，如T307P、L309Q和Q311R突变可使抗体对ProteinA 亲和力减弱，同时增强对FcR的相互作用，再通过PA亲和树脂，就可将改造过的双特异性抗体与副产物分离开。针对ProteinG结合力的抗体改造是最新的研究进展。Ollier等针对抗体的Fc区设计了15种突变位点，其中大部分可消除抗体对PG的亲和力，而不影响Fc与FcR之间的相互作用，且保留了对ProteinA的亲和作用，使得进一步纯化成为可能。其中M428G可改变IgG1的CH3结构域间的空间等效性影响抗体对ProteinG的亲和力，K213V 是在Fab进行的突变，也可消除抗体对ProteinG的亲和，而N434A则用于恢复对FcR的结合作用。通过两种或三种突变的联合使用，可使改造抗体在ProteinG 和ProteinA亲和层析后纯度达到95%以上。以上两种方法都可以在不改变抗体的活性和稳定性的条件下，对双特异性抗体进行高效快速的分离纯化，为双特异性抗体的大规模、商品化生产奠定基础。

三、问题与思考

双特异性抗体在临床前研究中，往往表现出显著的肿瘤杀伤作用，但是其临床试验结果，常常达不到研究者们的预期。双特异性抗体结构本就较天然抗体复杂，且大多进行多种修饰改造，使得对其结构表征的研究难以开展。通过质谱研究抗体的糖基化水平和位置，可帮助分析其功能和稳定性。双特异性抗体在临床实际应用的过程中，也面临着许多问题。目前已经通过审批的双特异性抗体，多是小分子的肽段或蛋白，为使血液中的药物含量能保持在治疗水平，患者需要频繁持续注射药物。通过改造抗体的Fc结构域，可有效延长抗体的半衰期至5~7d，大大减少患者的注射频率和次数，利用改造的病毒作为载体包裹双特异性抗体，也可以使抗体在体内的作用时间大幅延长，是解决抗体半衰期问题的新思路。双特异性抗体在临床应用中引起的并发症也使其未来蒙上阴影。介导T细胞的双特异性抗体在参与治疗的过程中，会有极高的风险诱发细胞因子释放综合征( CRS) 。CRS 是由于免疫效应细胞和肿瘤细胞交联，导致大量炎症因子释放，引起严重的全身炎症反应。而通过逐步给药和糖皮质激素治疗可缓解CRS 的症状。用于治疗血友病等凝血相关的双特异性抗体，由于作用机制与传统药物不同，难以通过体外实验确定其安全剂量，在临床使用时常会导致血栓栓塞。这些问题大多由于对双特异性抗体在体内的作用机制尚不明确导致，抗体在体内的作用机制以及体内环境对抗体的影响等问题还有待进一步实验去解答。针对体内工作环境对双特异性抗体进行改造，或开发合适的抗体载体，以及建立安全有效的生物学活性评价模型，将是下一步研究的重点。

近年来，双特异性抗体的设计开发方法已日趋成熟，新的工艺技术的应用使双特异性抗体的开发更加简便，结构更加稳定，治疗效果也有所提升。临床应用方面，除了应用于肿瘤相关治疗，多种用于治疗自身免疫性疾病、病毒感染性疾病的双特异性抗体也正处于临床试验中，部分药品已获批进入临床Ⅲ期阶段，双特异性抗体具有着广阔的应用前景。但是双特异性抗体的大规模生产和纯化等工艺问题仍有待解决。由于缺乏安全可靠的体外及动物模型，难以评价其生物安全性及进行体内药代动力学研究。CRS、血栓栓塞、腹泻、呼吸衰竭等不良反应存在也影响双特异性抗体的发展。同时双特异性抗体的半衰期也尚待改善。如何解决这些问题，将是下一阶段双特异性抗体的研究重点。相信随着各大医药公司临床研究项目的进行，以及上下游各工艺技术的完善与进步，双特异性抗体的作用机制终将被揭晓，大规模生产亦指日可待，双特异性抗体必将成为肿瘤及其它疾病治疗领域的新希望。