1内毒素

内毒素(endotoxins， ET)又名脂多糖(LPS)或类脂A，随着革兰氏阴性菌(GNB)的生长，分裂和死亡的过程中释放到周围环境中的有毒物质。内毒素是细胞壁外壁层上的特有结构，尤其是在细胞破碎后，便会有大量的内毒素释放出来，分布在空气中的每个地方。内毒素是一种相对分子质量很高的复合物，在化学结构上主要由多糖(PS)和类脂A (Lipid A)组成。类脂A是内毒素的活性中心，主要由氨基葡萄糖、磷酸和10-18个碳的长链脂肪酸组成，多糖又可分为0-特异性多糖链(O-Antigen)和核心寡聚糖(Core oligosaccharide)两部分。

2内毒素的去除方法

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的固有成分，并在其生长，分裂，死亡和细胞壁破碎或溶解的过程中释放出来。因此，内毒素在各种溶液中及接触水溶液的器壁上都是存在的，可以说是无处不在，是大多数生产原料、生物材料、药品、生物制剂的污染源。内毒素分子的热稳定性极高，在250℃干热下长达1小时才会被分解。内毒素分子对pH值变化也不敏感，虽高浓度的酸碱或强氧化剂可使之失活，但在实际应用中具有很多困难，特别是去除蛋白质溶液体系中的内毒素。目前，临床上对于内毒素血症的治疗尚无有效的治疗方法，主要采用抗E5、 HA 21A、抗TNF的单克隆抗体等免疫球蛋白进行治疗，由于这些药物价格昂贵以及可能引起过敏反应，在临床上使用受到限限，而且在临床试验性治疗中并未能获得如动物模型中那样令人鼓舞的结果，有的甚至显示有害作用。由于内毒素具有很强的热源性以及稳定性，少量即可引起发烧、血液循环障碍甚至休克死亡，因此需将其从生物样品中去除100内毒素去除方法有很多，

根据不同的作用方式，可分为以下三类，

（1）非选择性方法， 主要指超滤法、活性炭吸附法和相分离法;

（2）层析法，主要包括离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析;

（3）选择性方法，主要指亲和吸附法，此外还包括金属整合物吸附法和氢氧化铝吸附法。

2.1超滤法和荷电微孔滤膜法

超滤法是基于分子量的大小差异，采用不同的微孔滤膜，将样品中的内毒素去除，适于水或小分子溶液中内毒素的去除，对于蛋白质等生物大分子溶液来说，在去除内毒素的同时， 目标样品损失较多。荷电微孔滤膜法是根据内毒素分子在中性条件下带净负电荷，因而选择带有净正电荷材质的微孔滤膜，如聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等可增强对内毒素分子的去除效果。

2.2石棉及活性炭吸附法

基于多空吸附的活性炭吸附法主要用于去除相对分子质量较大的内毒素，这种方法适合于组分较为简单的水或小分子的溶液，以及疏水性较小的低分子量蛋白质或多肽溶液中内毒素的去除，且在微酸性环境效果更好。但由于活性炭的选择性较差，易吸附有效成分，且纯化后溶液中残余的活性炭不易去除，因此目前已很少使用。

2.3 化学降解法

化学降解法是指用强酸、强碱或强氧化剂，等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除。这种方法很可能造成目标产物的失活、流失或降解，这对具有生物活性物质的溶液来说，去除污染的内毒素显然是不利的。

2.4 相分离法

用于相分离法去除内毒素的试剂主要有酚类、Triton X-114 及Triton X-100 等。Triton是一类非离子型表面活性剂，有Triton X-114 和Triton X-100 两种。在低温时，Triton在水相中的溶解度高，此时内毒素也会溶解在其中；但随着温度的升高，Triton的溶解度逐渐降低，当温度升高到一定点时(通常在 25 °C以上)，Triton便会与内毒素一起在水相中形成沉，Triton淀，通过离心的方法去除沉淀，上清样品中的内毒素就被去除了。采用Triton X-114，发展了一种从大量重组体蛋白制品中去除内毒素的方法。据此文报道，利用这种相分离法，对内毒素的去除率达高于 99%，蛋白质的回收率也在 90%以上，且不影响有效成分的活性。此方法操作简单、快速，内毒素去除率高。但该方法处理量小，并且处理过程中有低温到高温的温度变化，这对一些不稳定的蛋白质是极为不利的，另外蛋白

质溶液中残留的Triton给后续操作带来不便，因此该法也很少使用。便会与内毒素一起在水相中形成沉

2.5 离子交换色谱法

离子交换色谱法是根据内毒素等电点较低，在一般条件下带有较多的净负电荷性质，采用阴离子交换色谱，使内毒素与目标样品分离开来，以达到去除内毒素目的。这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。内毒素分子具有化学属性不均一性，性质受溶液环境的影响较大，常与蛋白质发生相互作用，导致离子交换层析法去除内毒素不彻底。Rishard等考察了影响离子交换层析法去除内毒素的各种因素，通过增大样品缓冲液电导和提高溶液PH值的方法，来减弱内毒素与蛋白质之间的相互作用，从而达到提高内毒素的去除率，减少蛋白质的损失率目的，最终蛋白质中内毒素的含量可降至0.5EU/pg，工艺放大后蛋白质的回收率仍可保持在 80%以上。

2.6 亲和色谱法

亲和色谱法是利用物质的生物学特性来达到物质的分离，是一种高效能、高选择性去除内毒素的方法。亲和吸附法通常会涉及到各种亲和吸附剂的制作和使用，这就需要找到适当的亲和配基，将它固定到琼脂糖等聚合物的基质上合成出亲和介质。目前用于内毒素去除的亲和配基大致有以下几种：多粘菌素B/E、组胺、组氨酸、精氨酸、壳聚糖、脱氧胆酸、聚赖氨酸和聚乙烯亚胺以及一些聚阳离子配基等。除了上述亲和吸附剂外，还有将金属鳌合亲和吸附剂用于内毒素的去除。Luo等采用金属鳌合亲和层析去除内毒素以净化人体血液，取得较好的结果。由于存在金属离子泄漏等安全性问题，该方法用于生物制品及医药制剂中内毒素的去除还有待于进一步研究。亲和吸附剂对目标产品中内毒素的吸附，具有高度的特异性和选择性，这种相互作用主要是通过配基分子上的正电荷基团与内毒素的磷酸基之间的离子作用，以及与内毒素的类脂A部分之间的疏水作用的协同结果，与其它方法相比更能有效地去除生物制品中的内毒素。

2.7聚羟基脂肪酸酯（PHA）法

本论文研究制作的亲和颗粒（rh LBP- Pha P-PHB 颗粒）的内毒素去除率可达 90%以上，并且内毒素的去除率和蛋白质的回收率几乎不受离子强度的影响，但是酸碱度对其有一定的影响。我们的研究结果表明，基于rh LBP- Pha P-PHB 颗粒的内毒素去除系统，具有准备简单，无毒和高效的特点，非常适合蛋白质纯化工艺中内毒素的去除。

内毒素的定义及去除方法（超滤法和荷电微孔滤膜法、石棉及活性炭吸附法、化学降解法、相分离法、离子交换色谱法、亲和色谱法、聚羟基脂肪酸酯（PHA）法）

1内毒素

内毒素(endotoxins， ET)又名脂多糖(LPS)或类脂A，随着革兰氏阴性菌(GNB)的生长，分裂和死亡的过程中释放到周围环境中的有毒物质。内毒素是细胞壁外壁层上的特有结构，尤其是在细胞破碎后，便会有大量的内毒素释放出来，分布在空气中的每个地方。内毒素是一种相对分子质量很高的复合物，在化学结构上主要由多糖(PS)和类脂A (Lipid A)组成。类脂A是内毒素的活性中心，主要由氨基葡萄糖、磷酸和10-18个碳的长链脂肪酸组成，多糖又可分为0-特异性多糖链(O-Antigen)和核心寡聚糖(Core oligosaccharide)两部分。

2内毒素的去除方法

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的固有成分，并在其生长，分裂，死亡和细胞壁破碎或溶解的过程中释放出来。因此，内毒素在各种溶液中及接触水溶液的器壁上都是存在的，可以说是无处不在，是大多数生产原料、生物材料、药品、生物制剂的污染源。内毒素分子的热稳定性极高，在250℃干热下长达1小时才会被分解。内毒素分子对pH值变化也不敏感，虽高浓度的酸碱或强氧化剂可使之失活，但在实际应用中具有很多困难，特别是去除蛋白质溶液体系中的内毒素。目前，临床上对于内毒素血症的治疗尚无有效的治疗方法，主要采用抗E5、 HA 21A、抗TNF的单克隆抗体等免疫球蛋白进行治疗，由于这些药物价格昂贵以及可能引起过敏反应，在临床上使用受到限限，而且在临床试验性治疗中并未能获得如动物模型中那样令人鼓舞的结果，有的甚至显示有害作用。由于内毒素具有很强的热源性以及稳定性，少量即可引起发烧、血液循环障碍甚至休克死亡，因此需将其从生物样品中去除100内毒素去除方法有很多，

根据不同的作用方式，可分为以下三类，

（1）非选择性方法， 主要指超滤法、活性炭吸附法和相分离法;

（2）层析法，主要包括离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析;

（3）选择性方法，主要指亲和吸附法，此外还包括金属整合物吸附法和氢氧化铝吸附法。

2.1超滤法和荷电微孔滤膜法

超滤法是基于分子量的大小差异，采用不同的微孔滤膜，将样品中的内毒素去除，适于水或小分子溶液中内毒素的去除，对于蛋白质等生物大分子溶液来说，在去除内毒素的同时， 目标样品损失较多。荷电微孔滤膜法是根据内毒素分子在中性条件下带净负电荷，因而选择带有净正电荷材质的微孔滤膜，如聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等可增强对内毒素分子的去除效果。

2.2石棉及活性炭吸附法

基于多空吸附的活性炭吸附法主要用于去除相对分子质量较大的内毒素，这种方法适合于组分较为简单的水或小分子的溶液，以及疏水性较小的低分子量蛋白质或多肽溶液中内毒素的去除，且在微酸性环境效果更好。但由于活性炭的选择性较差，易吸附有效成分，且纯化后溶液中残余的活性炭不易去除，因此目前已很少使用。

2.3 化学降解法

化学降解法是指用强酸、强碱或强氧化剂，等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除。这种方法很可能造成目标产物的失活、流失或降解，这对具有生物活性物质的溶液来说，去除污染的内毒素显然是不利的。

2.4 相分离法

用于相分离法去除内毒素的试剂主要有酚类、Triton X-114 及Triton X-100 等。Triton是一类非离子型表面活性剂，有Triton X-114 和Triton X-100 两种。在低温时，Triton在水相中的溶解度高，此时内毒素也会溶解在其中；但随着温度的升高，Triton的溶解度逐渐降低，当温度升高到一定点时(通常在 25 °C以上)，Triton便会与内毒素一起在水相中形成沉，Triton淀，通过离心的方法去除沉淀，上清样品中的内毒素就被去除了。采用Triton X-114，发展了一种从大量重组体蛋白制品中去除内毒素的方法。据此文报道，利用这种相分离法，对内毒素的去除率达高于 99%，蛋白质的回收率也在 90%以上，且不影响有效成分的活性。此方法操作简单、快速，内毒素去除率高。但该方法处理量小，并且处理过程中有低温到高温的温度变化，这对一些不稳定的蛋白质是极为不利的，另外蛋白

质溶液中残留的Triton给后续操作带来不便，因此该法也很少使用。便会与内毒素一起在水相中形成沉

2.5 离子交换色谱法

离子交换色谱法是根据内毒素等电点较低，在一般条件下带有较多的净负电荷性质，采用阴离子交换色谱，使内毒素与目标样品分离开来，以达到去除内毒素目的。这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。内毒素分子具有化学属性不均一性，性质受溶液环境的影响较大，常与蛋白质发生相互作用，导致离子交换层析法去除内毒素不彻底。Rishard等考察了影响离子交换层析法去除内毒素的各种因素，通过增大样品缓冲液电导和提高溶液PH值的方法，来减弱内毒素与蛋白质之间的相互作用，从而达到提高内毒素的去除率，减少蛋白质的损失率目的，最终蛋白质中内毒素的含量可降至0.5EU/pg，工艺放大后蛋白质的回收率仍可保持在 80%以上。

2.6 亲和色谱法

亲和色谱法是利用物质的生物学特性来达到物质的分离，是一种高效能、高选择性去除内毒素的方法。亲和吸附法通常会涉及到各种亲和吸附剂的制作和使用，这就需要找到适当的亲和配基，将它固定到琼脂糖等聚合物的基质上合成出亲和介质。目前用于内毒素去除的亲和配基大致有以下几种：多粘菌素B/E、组胺、组氨酸、精氨酸、壳聚糖、脱氧胆酸、聚赖氨酸和聚乙烯亚胺以及一些聚阳离子配基等。除了上述亲和吸附剂外，还有将金属鳌合亲和吸附剂用于内毒素的去除。Luo等采用金属鳌合亲和层析去除内毒素以净化人体血液，取得较好的结果。由于存在金属离子泄漏等安全性问题，该方法用于生物制品及医药制剂中内毒素的去除还有待于进一步研究。亲和吸附剂对目标产品中内毒素的吸附，具有高度的特异性和选择性，这种相互作用主要是通过配基分子上的正电荷基团与内毒素的磷酸基之间的离子作用，以及与内毒素的类脂A部分之间的疏水作用的协同结果，与其它方法相比更能有效地去除生物制品中的内毒素。

2.7聚羟基脂肪酸酯（PHA）法

本论文研究制作的亲和颗粒（rh LBP- Pha P-PHB 颗粒）的内毒素去除率可达 90%以上，并且内毒素的去除率和蛋白质的回收率几乎不受离子强度的影响，但是酸碱度对其有一定的影响。我们的研究结果表明，基于rh LBP- Pha P-PHB 颗粒的内毒素去除系统，具有准备简单，无毒和高效的特点，非常适合蛋白质纯化工艺中内毒素的去除。

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