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近年来，毕赤酵母表达系统开始崭露头角，Eptinezumab是首款采用毕赤酵母表达的抗体药物。毕赤酵母不仅拥有原核生物表达系统的优势，本文详细讲述了酵母表达表现型Mut+和Muts，酵母表达同源重组方式整合分析，酵母表达载体选择及其与大肠杆菌表达系统的区别，酵母表达原理及酵母蛋白表达实验SOP。

酵母蛋白表达系统

酵母表达系统是真核表达蛋白的常用系统之一，具有真核表达系统的许多优点：如生产成本低、发酵周期短、易于培养、操作简单方便、可大规模生产、基因遗传稳定等；它还有哺乳动物细胞表达系统的诸多优势，如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。因此，毕赤酵母受到越来越多研究机构和医药生产企业的青睐。特别是与CHO细胞相比，毕赤酵母有诸多优势，首先毕赤酵母与CHO细胞都是真核细胞，拥有高等真核表达系统的诸多优点；其次，毕赤酵母构建细胞株更快，不需要耗时的病毒清除验证步骤，极大缩短了研发周期；最后，从生产方面而言，毕赤酵母有更快、更容易、更便宜、更高产量的特点，还可以高密度、大规模培养，大幅降低抗体药物的生产成本。（下文所提到的酵母蛋白表达均为巴斯德毕赤酵母）

酵母蛋白表达与大肠杆菌表达的区别

酵母蛋白表达与大肠杆菌表达有部分不同，大肠杆菌表达只需将质粒/载体转入到宿主菌体内，其载体携带复制起始点随着宿主染色体的复制而复制，可以稳定存在。而酵母表达相对复杂，设计的质粒/载体均不带有酵母自身复制起始点，因此如果直接导入到宿主菌中，不能稳定存在。所以必须将质粒/载体线性化，以同源重组的方式与宿主菌的染色体进行整合，这样外源基因才能够稳定存在，而且同源重组一旦形成会很稳定，在通过后期的筛选排除没有整合成功的质粒/载体和宿主菌，挑选整合成功并能够高表达的重组转化子，某种程度上与哺乳动物稳定细胞系构建原理类似。

毕赤酵母蛋白表达系统构成

该部分内容可参照本公众号的文章：酵母表达外源蛋白原理

毕赤酵母表达系统机制/原理

毕赤酵母能够高效的表达外源基因，是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子（AOX1和AOX2）。AOX1和AOX2及其产生的Mut^s和Mut⁺表现型前文已经叙述过。AOX1受甲醇的诱导和葡糖糖或甘油的抑制。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上，通过把构建的质粒/载体线性化（主要采用酶切），通过同源重组的方式整合到启动子AOX的下游，一般是插入到5’AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。

①毕赤酵母同源重组的方式

质粒/载体和酵母表达基因图谱

图1：载体图谱：5'AOX1启动子位点，

转录终止子TT，3'AOX1位点

图2：酵母宿主菌基因

※质粒载体上的PAOX位点（PAOX启动子）或PAOX转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点与酵母宿主菌基因发生同源重组

在酵母宿主菌基因组的下游或者上游插入一个或多个质粒载体基因。如插入的质粒载体不破坏酵母宿主菌基因本身的AOX1，那么重组转化子的表现型不变为Mut⁺，反之为Mut^s。

图3：重组质粒插入3’AOX1

※质粒/载体基因替换酵母宿主菌的AOX1位点

酵母宿主菌的AOX1启动子位点被质粒/载体基因完全替代，原有的酵母AOX1启动子被破坏，表现型为Mut^s,取代其的是质粒/载体基因组上的PAOX，目的基因，HIS4表达序列。取代事件发生的概率较基因插入事件要小。

图4：AOX1位点被替换

※多拷贝插入

简单来说就是质粒/载体基因的多次插入（插入到酵母宿主菌基因组上），自发概率很低

酵母表达转化方法比较

培养好的酵母宿主菌和构建好的质粒进行同源重组的转化方法有以下几种，都是基于线性化质粒/载体之后，线性化是转化的第一步，用限制酶酶切。

※转化方法

转化方法	转化效率	是否会多拷贝整合	操作
原生质体法	10^5	是	操作复杂
电穿孔法（电击）	10^5	是	操作方便
PEG诱导转化	10^3	否	操作方便