*途中黄色实心圆点代表包涵体

1.表达量过高。蛋白的合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2.重组蛋白的氨基酸组成：一般来说含硫氨基酸越多，越容易发生二硫键的错配，因此越易形成包涵体。而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3.重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42℃）或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

5.蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键。

6.在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。

1.可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。

2.降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30%
3.包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。

4.包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后复性前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。

1.对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。
2. 要求复杂和精确的复性过程
3. 复性过程的收率往往很低，经常成为放大的瓶颈
分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤：
破碎细胞→分离包涵体→溶解包涵体→蛋白质产物的构象复原

1,包涵体的提取：基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用机械破碎或超声破碎菌体。单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。细菌裂解后,使用5000-20000g离心15min，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。

2,洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

3,包涵体的溶解：①采用高浓度的变性剂，使包涵体形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。②去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。③极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mM HCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。④还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

4.复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。

①稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

②透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

③超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

④柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）

⑤高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。

⑥分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。

复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几，如在纯化IL-2时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子（0.05%SDS，7.5-30uM CuCl2）的方法，25-37°C下反应3小时，再EDTA至1mM终止反应，复性后的二聚体低于1%。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。

①蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而，一般浓度控制在0.1-1mg/ml；如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝聚的缘故。所以一般采用在水浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液过程中始终处于低浓度状态。

②pH和温度：复性缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0-9.0。

此外，影响复性效率的因素还有，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

①氧化-还原转换系统：对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有：空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.

最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG,而cysteine / cystine、cysteamine / cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有应用。氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用1-3mM还原型巯基试剂,还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10:1~5:1。

②添加低分子化合物：低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4M Tris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。浓度为0.4-0.6M L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度。成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。

NDSBs是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族, NDSBs由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水集团组成，故不属于去垢剂,不会形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195，NDSB-201，NDSB-256。

③PEG-NaSO4：两相法用PEG和NaSO4作为成相剂,然后加入盐酸胍，再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行复性,但这种方法需复性的变性蛋白质维持在低浓度水平。

④分子伴侣和折叠酶等：这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。

此外，提高复性率的方法还有很多，如：非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂CHAPs、Triton X-100、磷脂、laurylmaltosid、Sarkosyl等对蛋白质复性有促进作用；待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。