细胞培养液澄清

在细胞培养过程中，在重组单抗分泌到培养液的同时，培养液中也含有大量的细胞颗粒、碎片、细胞器及细胞DNA。工业化规模的细胞培养液澄清通常由三个步骤完成，具体步骤见图1。第一步处理通常设置为离心，培养液中的细胞和细胞碎片通过离心去除后可大大减轻后续深层过滤或者微滤步骤的负荷。离心操作可分为批处理模式和连续流模式。批处理模式适用于实验室规模，而连续流模式可以处理更大的培养液体积，更适用于工业化规模。随着低离心剪切力离心机的发展，离心、过滤的混合型离心机在细胞澄清步骤的应用已经越来越广泛。在细胞培养液中加入一定的絮凝剂，可以使细胞悬浮物如细胞碎片等更易离心去除，进一步改善细胞培养液的澄清度，减少深层过滤的步骤。而微滤在细胞培养液澄清中，其效果要好于离心机，且其成本较低，但微滤会扩大料液体积3~4倍，导致后续纯化负担增加，不利于工业化生产。

深层过滤和切向流过滤通常在澄清过程的第二步使用。对于大规模纯化，深层过滤处理的体积相对比较小，而切向流过滤则具有更大的处理能力，并兼具浓缩的功能。但深层过滤使用方便、清洁、高效，在重组单抗的工业纯化中应用广泛。深层过滤属于非均相分离，能够使料液通过整个多孔介质而不仅仅是表面过滤，并且可以很好地防止下游层析柱的堵塞。在生物医药工业中，深层过滤器通常由纤维素或聚丙烯纤维组成的滤床以及硅藻土组成的支架构成。深层过滤的主要目的是去除细胞培养液中的细胞碎片、部分色素、细胞器等物质，可以在过滤固体含量比较小的悬浮体中使用，也可以在固体含量比较大的情况下使用。在深层过滤中增加排阻和电吸附作用，则能更有效地截留污染物。澄清的最后一步是0.22μm的膜过滤，能有效地去除固体颗粒和细菌，有报道指出在深层过滤器末端增加0.22μm的过滤膜，能减少澄清过滤的操作步骤。

抗体捕获

捕获的目的是浓缩和获得高纯度的蛋白，这个步骤通常使用离子交换或亲和层析法。离子交换的原理是基于蛋白质分子的表面电荷和色谱基质上相反电荷的基团之间的相互作用。结合在基质上的蛋白质可以通过改变pH或者盐浓度进行分离。离子交换是最常用的分离和纯化蛋白质的色谱技术，其具有高容量、长寿命、低成本等特点，且操作简单、易于控制，但其通常只能将蛋白纯化至中等纯度。亲和层析是根据蛋白与配基之间的可逆的特异性作用进行抗体的捕获，高特异性是其主要特征。使用亲和层析一步纯化不仅可以得到有针对性的高收益抗体，同时细胞培养液中的宿主细胞蛋白质、DNA等物质可以大量的去除，且多种抗体类型都能找到其相应的亲和填料。

随着层析介质载量和重复利用性能的不断优化，目前亲和层析已经成为重组单抗纯化的首要选择。最成功的例子就是用ProteinA捕获单克隆抗体，该法具有很多的优点：①特异性好，一步纯化所得抗体的纯度大于95%；②具有浓缩的作用，洗脱液的抗体浓度高于10g/L，大大减少了后续纯化溶液处理体积；③低pH洗脱并孵育，可以有效灭活病毒；④适用于所有人源的（除IgG3）抗体和Fc融合蛋白。但同时也存在一定的局限性：①ProteinA凝胶价格昂贵，比普通色谱介质的价格高数倍；②低pH条件下洗脱，抗体分子容易形成聚集体和沉淀；③ProteinA配基脱落，需在后续纯化中去除。可以采用以下策略解决上述问题：①适当提高抗体洗脱缓冲液的pH值，更有利于重组单抗的稳定；②在洗脱缓冲液中加入一些蛋白稳定剂，如精氨酸、尿素等，能够有效抑制聚集体的形成；③在低温条件下进行层析操作，也可降低重组单抗的聚集。

亲和层析介质非常多，以下几种亲和层析介质在重组单抗的纯化中有广泛的应用，其中ProteinA是从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的一种蛋白质，它能够特异性地与哺乳动物IgG的Fc区域结合；ProteinG是从G类链球菌中分离出来的胞壁蛋白，能与IgG Fc区域相结合。天然的ProteinG和血浆中的白蛋白有亲和力，因此通过基因工程重组的ProteinG去掉了白蛋白的亲和位点；ProteinL对不同的IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD都有亲和力。轻链的Kappa区域可以和ProteinL结合，但是和lambda区域没有亲和作用，纯化方法建立之前，需要鉴定抗体的类型，以便选择正确的层析填料来分离纯化。不同抗体类型在选择亲和层析介质上面也有差异：①嵌合抗体、人源化抗体可以选择ProteinA或者ProteinG亲和填料；②Fc融合蛋白选择ProteinA层析填料；③Fab片段或scFv单链选择ProteinL；④单区域抗体sdAb通常有VH区域，可以使用ProteinA作为捕获步骤。

抗体精制纯化

虽然亲和层析可以快速去除大量杂质，但很难将这些杂质去除到规定浓度以下，后续可以采用精制色谱方法，如阳离子交换层析（CEX）、阴离子交换层析（AEX）、疏水作用层析（HIC）等，来去除宿主细胞蛋白质、高分子聚合物、DNA、内毒素和脱落的亲和配基等杂质。阳离子交换层析通常采用吸附-洗脱模式，主要的目的在于去除DNA、宿主细胞蛋白质、脱落的亲和配基和内毒素。在洗脱过程中，杂质与阳离子介质结合力弱而被除去，而重组单抗则吸附在填料上，再通过改变pH或者增加盐离子浓度将目的蛋白洗脱下来。阴离子交换层析一般采用流穿模式进行纯化，去除残留的DNA、内毒素及聚合物。在流穿模式中，用脱盐或者稀释的方式将溶液的盐离子浓度调低，使重组单抗流穿而微量杂质保留在柱子上，以此达到去除内毒素和DNA的目的。阴离子交换层析有处理量大、动态载量高、操作简单的优势，适合最后精制步骤除去痕量杂质。疏水作用层析是采用高盐上样，低盐洗脱模式，通过强离子浓度变化进行目的蛋白与杂质之间的分离，能有效除去宿主细胞蛋白、DNA和病毒等杂质。通常情况下，会选用两步柱层析作为精细纯化步骤，一方面是为了获得高纯度的样品，一方面是保证足够高的产品得率。AEX和HIC通常采用流穿模式，这是因为单抗的等电点通常比较高，而且这种模式具有比结合-洗脱模式更高的载量。然后将流穿的样品再用CEX进行纯化，CEX可采用梯度洗脱模式，使单抗样品的纯度达到最大值。

病毒灭活

在抗体纯化过程中除了要考虑回收率和纯度外，还需考虑如何有效地灭活清除病毒，FDA Q5A指导性文件要求使用额外的两个不同步骤来去除病毒，以确保实现重组哺乳动物细胞产品的安全性。

不同类型的病毒清除有不同的方法，其中加热和辐射清除病毒是最有效的，但这些方法在重组单抗等生物制品中不适用。低pH孵育是重组单抗纯化中最常用的病毒灭活方法，通过将ProteinA洗脱液的pH调节至低于3.8并孵育一定时间，可以有效地去除脂质包膜病毒。但是将重组单抗溶液调至低pH容易导致重组单抗失活及聚集。经研究表明，在溶液中加入0.3~2mol/L的精氨酸，可以达到稳定重组单抗及减少聚集的作用。还有一些重组单抗溶液在中和pH的过程中，会产生浑浊沉淀，但沉淀中不一定含有重组单抗，在这种情况下，可用0.45μm或者0.22μm的滤膜过滤去除沉淀，也可用深层过滤的方法来去除这些沉淀。另外，非包膜病毒如鼠细小病毒由于具有较高的化学溶液耐受性，必须采用物理的方法来去除，其中吸附法和小孔径膜过滤法均被广泛应用。病毒过滤既可以采用切向流过滤，也可以采用盲端过滤，但采用切向流过滤往往导致样品浓度过低，因此盲端过滤法更为合适。病毒过滤器分为过滤逆转录病毒级别（<50nm）和过滤细小病毒级别（<20nm）。病毒过滤的步骤可以设计在精制过程中的任意步骤之后，通常在恒定的压力下进行。由于病毒过滤器的孔径特别小，尤其是细小病毒级别的过滤器，在样品含有聚集体情况下很容易造成堵塞，必须增加过滤的操作压力来解决这一问题。

纯化工艺放大

目前细胞的培养规模越来越大，从12000~15000L到在建的20000L细胞培养规模，同时多个细胞培养罐并行运行。这些极大地推动了大规模蛋白质纯化技术的发展：从批产几公斤，年产几十公斤重组单抗发展到批产几十公斤，年产上十吨的规模。同时，新型凝胶技术、更大规模的纯化生产系统技术和膜过滤技术的发展，缩短了重组单抗纯化时间，进一步节约了投资，提高了产能和产率。目前商品化的ProteinA填料在线性流速大于500cm/h，结合时间小于2.4min的条件下，动态载量高达38mg/ml。离子交换工业层析柱在直径60cm、柱高30cm的情况下线性流速可高达500cm/h。这些纯化技术的发展不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，缩短操作时间，能够有效避免抗体分子产生各种变体和聚集体。

治疗所需的高品质重组单抗需要高效的上游和下游的制造流程。当生物反应器从摇瓶放大到试生产规模，下游工艺也必须按比例增加。纯化工艺放大通常包括两个步骤：第一步从实验室到中试规模增加50~100倍，第二步从试生产规模到全生产规模增加10~50倍。下游工艺的放大不仅是单纯增加大小和实验室设备的体积，大规模纯化过程中使用的管道尺寸变大、过滤器变大、泵类型不同、死体积增大均会导致纯化放大出现困难。且不同的亲和填料应进行筛选以实现高的生产速率，同时必须具有高的动态结合载量并能够在低反压下工作。柱体积根据所需结合能力必须计算出最佳柱床高度、流速和动态能力。停留时间等于该柱床的高度除以流体的线速度，线速度必须保持恒定。运行流量不应该超过最大流量的70%。按比例放大之前，需选择那些寿命长，一致性好，稳定的层析填料。比例放大时，柱体积应保持柱床高度的恒定而只增加柱径，每单位填料的蛋白质载量应该是相同的，线性流动速度也应该相同。

目前主要使用的常规色谱层析方法在工艺放大方面具有较高的限制，当前重组单抗纯化的下游处理能力已不能满足细胞培养液体积快速提高的需求，同一批细胞培养液往往需要通过多次色谱纯化才能完成。工艺放大的瓶颈突出表现在缓冲液及纯化中间体的储罐大小有限，还有层析柱直径超过2m后常常出现液流分配问题和装柱问题。近年来出现了一些如选择性沉淀或高选择性液液分离的非色谱纯化技术，以及模拟移动床色谱、双水相萃取、膜色谱等各方面技术，处理能力可达10kg/L以上，大幅度提高了单次样品的处理量。这些新技术的出现，将弥补常规色谱技术处理量方面的不足。

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