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菌种建库简介

用于质粒生产的工程菌种、用于病毒生产的细胞均属于起始原材料，是细胞和基因治疗的基础，必须建立两级或三级种子库系统。种子库需经过充分的质量检定，从而最大程度的控制污染风险；此外，种子库必须具有足够的数量和良好的均质性，确保研发与生产周期内菌种来源的一致性。在构建种子库时，需重点关注以下四个方面：溯源性、建库过程合规性、检定要求和稳定性研究。

建库注意事项

三级种子库包括原始种子库（pre-master cell bank，PCB），从原始种子批传代、扩增后保存的为主种子库(master cell bank，MCB)，从主种子库进行批传代、扩增后保存即为工作种子库(working cell bank，WCB)；每批种子库都应按规程的要求进行保管、检定和使用。为了保障生物制品的安全性，必须对其进行严格的检测，确定其达到相关技术标准要求。

一，溯源性：

种子库上游构建资料中需包括基因、载体和宿主细胞的来源及改造过程，要求来源明晰、历史过程清楚。

①目的基因：应当说明其来源、设计和改造过程，提供序列信息和测序结果，申报资料中要对改造的合理性进行说明。

②表达载体：提交表达载体的来源、名称、结构等信息，说明重组质粒的构建和检定过程。载体来源应当清楚，例如来自实验室构建、朋友赠送、外购或全基因合成等。

③宿主细胞：宿主细胞的来源要明确，提供其名称、生物学特性，检定结果等信息。

二，建库过程合规

建库流程：依照法规规定，从筛选到的高表达菌株单克隆经反复纯化扩增验证后，冻存于-80℃，即为原始种子库。取一只原始种子，复苏后扩增验证，然后混合一定浓度的甘油后在-80℃冻存，即为主种子库。取主种子进行复苏后扩增验证，然后混合一定浓度的甘油后在-80℃冻存，即为工作种子库。所有的种子都要严格记好株名、批号、编号、冻存日期、分装数量、放置位置及取用记录等。

注意：IND申报时，种子库构建需要特别注意下面几个问题：①需在GMP体系完成建库工作，建库流程、储存、运输过程都要形成SOP管理文件。②保证均质性，如果是使用了多个容器培养，分装前需要有合适的方法充分混匀。③为保证工作种子库、主种子库与原始种子库的生物学特性一致，建库过程中不得有单克隆挑选和菌种筛选的行为。

三，检定要求

种子库的质量需按照《中国药典》三部中的要求，种子库检定项目包括但不限于如下检测项目：

①菌落形态及抗生素抗性，考察菌种在含与不含抗生素华体会体育最新地址上生长的菌落形态及抗生素抗性。

②生化反应，考察工程菌是否具有典型的大肠杆菌生化反应。

③染色镜检，考察工程菌菌体形态及革兰氏类别。

④重组表达载体酶切检定，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒酶切后DNA片段大小符合理论值。

⑤基因序列测序，验证重组表达载体上的目的基因序列的正确性。

⑥电镜观察，通过电镜观察菌体形态，支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染情况。

⑦菌体目的蛋白表达检定，通过SDS-PAGE检测分析重组质粒是否表达目的蛋白。

⑧菌体表达蛋白免疫原性检查，通过Western-blot检测分析重组质粒表达的重组蛋白是否具有正确的免疫原性。

《中国药典》三部中规定了细胞基质的质量要求，包括：细胞鉴别（种属、株及专属特性）；外源因子污染检查（包括病毒性及非病毒性内外源因子）；成瘤性及致瘤性检测；染色体核型；均一性及稳定性等

四，稳定性研究

根据《中华人民共和国药典》相关要求，种子库要开展传代稳定性研究，明确限传代次数，使用寿命，评估是否能够满足未来商业化生产需求。在开展传代稳定性研究时应在模拟实际的生产条件下开展。通常对重组质粒稳定性和表达稳定性研究的方法为：对种子库菌种多代次培养，通过双酶切检测与菌体PCR检测，确定传代50次后质粒是否丢失。通过对传代50代的菌液诱导培养后，对菌体表达的目的蛋白量进行SDS-PAGE检测，确定传代后的表达稳定性。

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