高密度发酵技术可以提高菌体的发酵密度，提高产物的比生产率，不但可相应减少发酵规模和生产批次，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，从而大大提高产品竞争力。大肠杆菌的遗传背景研究比较透彻，加之其容易培养，生长速度快，表达载体丰富、大规模培养工艺成熟、表达量高等特点，使其成为应用最广泛的基因工程合成异源蛋白的原核表达系统。重组大肠杆菌高密度发酵受多种因素影响，如表达系统、华体会体育最新地址 组成、发酵条件控制、补料策略等，在实际操作中，需要对各影响因素进行优化，以建立最佳的发酵工艺。

一、高效表达系统的构建

为了获得高效表达的重组菌株，表达系统的构建是成功的关键。在构建重组菌时，宿主菌和载体的选择、偏爱密码子和启动子的选择、质粒拷贝数等都需全面考虑。

1，宿主菌和载体的选择

工业应用较成熟的大肠杆菌宿主菌有BL21系列、K802系列和JM109系列等。目前，高密度发酵广泛应用的BL21(DE3)plysS，因其自身携带有编码T7溶菌酶的小质粒，能保持较高的目的蛋白的表达水平，还能抑制宿主蛋白的表达，从而其作为宿主菌而被广泛应用。重组大肠杆菌中质粒载体的构建对外源基因的表达起着关键作用。常用的基因表达载体如pET、pUC、pSC、pPBB系列及其衍生的系列载体，在构建过程中要重点考虑宿主菌与质粒载体相兼容的问题，质粒与宿主菌相互作用、培养环境等都会影响到质粒在不同宿主菌中的稳定性，质粒的不稳定将直接影响目的蛋白的产量，因此在重组大肠杆菌高密度培养过程中需要尤其注意。

2，偏爱密码子和启动子的选择和诱导

每个物种对密码子利用都有一定的差异或偏爱，在蛋白质合成过程中，同义密码子的使用频次也不尽相同。因此在进行目的基因设计时应对密码子进行优化。

通过优化表达系统能实现目的蛋白的高表达。目前最成功的重组大肠杆菌诱导系统是受lac抑制物所调控的trp和lac杂合启动子。该系统需利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 进行诱导，目的蛋白能快速高效表达且专一性高，但IPTG价格昂贵并有一定毒性。另外，λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子和trp-lac杂合启动子等也是常用的诱导系统。λ噬菌体PL启动子受温敏cI857突变等位基因的调控，培养的温度改变即可调控PL启动子的诱导或关闭。然而该系统能耗过大，并易诱发热激基因蛋白的产生。应用较多的含PL启动子的质粒载体有pPLC24、pRE1、pG408N 等。T7噬菌体启动子系统因可使克隆化基因独立表达，并且某些在其他表达系统中不能有效表达的基因也能实现高效表达，因而倍受关注。pET、pTO-N、pGEM3Z 等是目前常用的T7启动子质粒载体。pMALc、pCW、pRX1等是目前常用的含tac启动子的质粒载体。

二、培养条件的选择

要实现高密度发酵，除了基于工程菌自身的表达特性外，还必须筛选出适宜其生长和目的蛋白表达的最适环境条件，包括适宜的华体会体育最新地址 组分、发酵控制条件、补料策略等。

1，华体会体育最新地址 组分

重组大肠杆菌的生长与表达所需的碳源、氮源、无机盐等物质均源自于华体会体育最新地址 。华体会体育最新地址 组分可分为合成华体会体育最新地址 、半合成华体会体育最新地址 和复合华体会体育最新地址 三种类型。大肠杆菌高密度发酵常用复合华体会体育最新地址 。

重组大肠杆菌高密度发酵中碳源的优化是关键。常用的碳源有糖类、油脂、低碳醇和有机酸等。葡萄糖作为价廉易得且最易于细菌利用，成为重组大肠杆菌发酵中最常用的碳源物质。高密度发酵华体会体育最新地址 中合适的初始糖浓度更利于菌体生长和目的蛋白表达，高浓度糖的存在会导致细菌生长过于旺盛，加速乙酸的积累，有研究表明最合适的初始糖浓度为10g/L 左右，超过50g/L 后大肠杆菌的生长会受到抑制。为了克服葡萄糖的缺陷，可选择甘油代替葡萄糖做碳源，由于两者进入三羧酸循环的路径不同，选用甘油能有效减少乙酸的产生，且甘油作为碳源大肠杆菌生长不至于过于旺盛，更适用于大肠杆菌的高密度发酵。因此在发酵过程中通过优化甘油浓度，获得最合适的发酵条件，实现目的蛋白的高效表达.

氮源是维持细胞正常代谢所必需的重要物质，酵母浸粉、蛋白胨及氨基酸等是重组大肠杆菌发酵最常选用的有机氮源、硫酸铵、氨水等常作为无机氮源。合适的氮源更利于大肠杆菌的生长和目的蛋白的表达。有机氮源受生产工艺的影响，不同厂家、不同品系的产品对发酵影响巨大，需要综合筛选。

在高密度发酵过程中，除了选择合适的碳源、氮源，碳氮比也是重要的考量因素，碳氮比不合适菌体微环境变差，生长受到抑制，继而影响蛋白的正常表达。通过调整华体会体育最新地址 中碳源、氮源浓度配比，获得华体会体育最新地址 组分的最佳配方。另外还要注意补料中过程的碳氮比，研究发现补料中葡萄糖与蛋白胨的配比不同对菌体生长和产蛋白表达有很大影响。

除了选择合适的碳源、氮源及碳氮比之外，还需要考虑微量元素、无机盐浓度等影响因素。磷酸盐不仅维持细菌的生长和渗透压平衡，还是发酵重要的缓冲盐，对质粒稳定性、生物量并外源蛋白表达都有着重要影响。向华体会体育最新地址 中添加一定量的Mg2+又是会提高蛋白的表达产量。

2，培养温度的选择

大肠杆菌的最适生长温度为37 ℃，后期诱导表达温度受各种因素影响。目的蛋白的表达形式多种多样，包括包涵体、可溶性表达等，其对温度的要求也不尽相同、37 ℃或更高的温度更利于包涵体的形成，而可溶性蛋白的表达则需要更低的温度，另外在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于实现发酵的高密度高表达。

温度对质粒拷贝数也有着重要影响，有研究表明高低温培养其差异可达数倍至数十倍，因此在发酵过程中要考虑温度对质粒稳定性的影响。温度对菌体生长和蛋白表达影响很大，在发酵过程中要综合目的蛋白特性、质粒性质、菌体状态等各种情况，实时控制温度。

3，pH 值控制

大肠杆菌生长的最适pH 值为6.8～7.2，稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。pH值范围也因宿主菌及所表达蛋白的性质的差异而不同。重组大肠杆菌生长阶段的最适pH值与表达阶段的最适pH值常常有所不同，因此在菌体生长的不同阶段维持不同的pH值能显著提高目的蛋白产量。为保持pH值的稳定，一方面需要使用酸、碱等调节pH值在适宜的范围内，另一方面在发酵过程中需要考虑在华体会体育最新地址 中引入适量浓度的缓冲盐体系，如磷酸盐、柠檬酸等，避免pH值的剧烈变化对工程菌生长与代谢产生的不利影响。

4，溶氧的控制

溶解氧直接参与菌体的氧化分解代谢过程，高密度发酵的溶解氧控制非常关键。在发酵中后期，随着菌体密度增加，单位体积发酵液的需氧量增加，菌液粘度升高，均会导致发酵溶氧逐级下降，低于临界氧浓度时菌体生长就会受到抑制。有研究发现，正常溶氧条件下质粒比较稳定，但当溶氧降至5%以下，质粒会快速丢失。因此，发酵过程中通常需要通过提高搅拌转速、增加通气量及通入纯氧等手段来维持溶氧，维持溶氧在临界氧浓度以上某个恒定区间，如30%～40%。随着溶氧检测手段从数字溶氧到光学溶氧的升级，溶氧检测更加灵敏、高效，更有利于溶氧敏感型工程菌的高密度培养。

5，诱导因素

重组大肠杆菌培养过程由细菌生长和目的蛋白表达两个阶段构成。菌体生长阶段即加入诱导剂之前，该阶段主要是为了获得更高的诱导前菌体密度，而表达阶段即诱导后，该阶段的主要目的是表达更多的目的蛋白。诱导因素通常包括诱导剂的选择、诱导剂浓度、诱导时机和诱导时间等。常用的诱导剂有IPTG、乳糖、半乳糖，以IPTG最为常用。虽然IPTG比乳糖更高效，但其有毒性，价格昂贵，乳糖受到越来越多的欢迎，有研究表明，乳糖与IPTG诱导效果相当，有的诱导效果甚至优于IPTG，因乳糖具有无毒、价廉且能被大肠杆菌当作碳源利用，因此可取代IPTG作为诱导剂，对于工业发酵生产重组蛋白具有重要意义。发酵过程中诱导剂加入会显著影响工程菌的生长和目的蛋白表达，诱导剂浓度对蛋白影响较大，因此需要摸索最合适的诱导剂浓度。

诱导剂的加入会启动目的蛋白表达，显著抑制菌体的生长，因此在较低的菌体密度下诱导就无法实现高密度发酵，而在过高的菌体密度下进行诱导，由于代谢副产物积累过多或菌体老化，可能会引起表达量偏低甚至菌体自溶，但也有研究表明在对数生长前期诱导，菌体密度虽然相对较低，但酶活在最高水平，因此发酵诱导时机也是高密度发酵需要考虑的重要因素，目前通常采用基础华体会体育最新地址 养料耗尽适当补料，待菌体达到较高的密度后进行诱导。受菌体生长状态和蛋白性质影响。诱导时间不尽相同，有研究表明随着诱导时间的延长，更有助于目的蛋白的累积，且菌体量逐步增大，但也有研究表明诱导时间越长后期目的蛋白表达增加并不显著，因此需根据不同品种的实际情况确定适宜的诱导时间。

6，补料策略的制定

结合重组大肠杆菌各阶段的比生长速率、养料消耗速率、产物生成速率、有害代谢产物的积累、质粒稳定性等动力学规律及其相互关系，选择合理的补料策略，是重组大肠杆菌发酵过程优化的关键。

由于基础华体会体育最新地址 养料浓度受限，要实现重组菌的高密度发酵，只能通过分批补料来维持工程菌的正常生长与表达。在过高的葡萄糖浓度或过低的溶氧状况下重组大肠杆菌会产生“葡萄糖效应”，累积大量有害物质(主要为乙酸)而影响重组菌的生长和异体蛋白的高效表达。因此在不同的时期制定合理的补料策略，降低葡萄糖效应，维持有害物质的低含量。

发酵补料可简单分为非反馈补料和反馈补料两种方式。非反馈补料有恒速流加、梯度流加和指数流加三种方式。恒速流加培养是以恒定的速率流加限制性的碳源，该方法简单易行，常用于培养周期较短的低密度发酵。该补料策略的缺点在于补料前期能满足菌体生长的需要，但随着菌体密度的增大发酵后期会存在养料供应不足而菌体生长受抑制的问题。梯度流加为指数流加的简化版，可以有效避免恒速流加后期养料匮乏的缺陷，根据发酵不同生长阶段的密度情况设置不同的补料流速梯度，以满足菌体对养料的需求。多项研究表明，通过分批补料发酵均实现了重组大肠杆菌的高密度培养。指数流加补料相对来说是最具优势的补料策略，补料速度与工程菌培养密度的指数增加相吻合，有利于获得更高的发酵密度，但该补料方法需要补料软硬件支持，需按照指数曲线精确控制各阶段不同的补料速度，对设备自动化要求较高。大量的研究表明，指数流加策略是大肠杆菌高密度发酵最常选用的补料策略。非反馈补料不足之处是其无法根据发酵环境的改变和大肠杆菌实时生长与表达状态进行反馈调节

反馈补料是根据发酵过程中pH值、DO等参数发生变化来判断工程菌的代谢状态，从而进行针对性补料的方法。反馈补料法在高密度发酵领域应用广泛，该补料法可根据所反馈的信息及时调整补料策略，从而高效调控营养物质浓度。恒溶解氧补料法、恒pH值补料法和CER(CO2排放率) 法是最常见的三种反馈补料策略。反馈补料往往具有一定的滞后性，这是因为其需根据反馈的信息时时调整补料策略，该过程中无法规避糖浓度的变化和发酵过程溶解氧的波动，从而导致代谢副产物的增多

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