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蛋白质是一种十分重要的生物大分子，其种类很多，结构多样，分子量相差也很大，因此建立一个比较通用或标准的定量方法是比较困难的。目前，测定蛋白的方法有多种，其优缺点也各不相同，因此，针对不同的目的，选择合适的蛋白测定方法尤为重要。目前常用的测定蛋白浓度的方法主要包括：紫外分光光度法、双缩脲法、Lowry法、Bradford法、BCA法、磺基水杨酸法、荧光染料定量法。

1、紫外分光光度法

检测原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从郎伯-比尔定律。

在使用此方法时，由于不同蛋白的序列不同，其所含有的酪氨酸和色氨酸所占总氨基酸的比例不同，因此造成了不同的蛋白具有不同的消光系数。在使用该方法进行测定蛋白浓度时，需要知道待测蛋白的消光系数，将通过紫外分光光度计测得的浓度除以蛋白的消光系数即为该蛋白的真实浓度。待测蛋白的消光系数可通过软件进行预测，在预测时只需要在网站中输入蛋白质的氨基酸序列即可给出相应的消光系数。预测蛋白消光系数的网址为：https://web.expasy.org/protparam/

2、双缩脲法

检测原理：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，在碱性溶液中也能与Cu2+络合成紫红色化合物（540nm）。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该方法适用于测定蛋白质浓度范围为1~10mg/mL。

蛋白质与Cu2+络合后的结构如下图：

3、Lowry法

检测原理：Lowry法是双缩脲法与福林酚法的结合与发展。Lowry法包括两步反应，第一步是在碱性条件下，双缩脲试剂（碱性铜试剂）先与蛋白质中的肽键其显色反应，生成蛋白质-Cu+络合物；第二步是将此络合物将Folin试剂反应，Folin酚试剂在Cu+的催化下，磷钼酸-磷钨酸盐被蛋白质中的芳香族氨基酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，其最大吸收峰在745～750nm处。在一定的浓度范围内，所形成蓝色的深浅与蛋白质含量之间有线性关系，可用于蛋白质含量的测定。该方法可检测蛋白的灵敏度范围在5～100μg/mL.

4、BCA法

检测原理：BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，再使用BCA鳌合Cu+作为显色剂，产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，颜色的深浅与蛋白质呈剂量相关性，可以根据在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。

该方法的优点为：①.灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg；②.不易受一般浓度去污剂的干扰，抗干扰能力强。③.在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。

该方法的缺点为：会受螯合剂及高浓度还原剂的影响。

5、Bradford法

检测原理：考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm，当与蛋白质结合时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大，在一定范围内反应液在595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，此时测定595nm处吸光度可以对蛋白进行定量；蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。（染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合）

6、磺基水杨酸法

检测原理：蛋白质为两性物质，在酸性环境中带正电荷，而磺基水杨酸根带负电，正好与蛋白质结合沉淀，显示液体中有蛋白存在。该方法是以浊度为变数测定蛋白质含量的，蛋白质浓度与浊度成正比。

7、荧光染料定量法

检测原理：NanoOrange是一种新型的用于蛋白质精确定量的荧光染料。当NanoOrange处于溶液状态时没有荧光活性，与蛋白作用后，在470-490nm处激发，产生570-590nm的发射光，发光的强度与蛋白质的含量具有一定的线性，可以使用荧光计对发光强度进行检测，根据标曲计算蛋白的含量。使用NanoOrange最低可以检测到100ng/ml的蛋白样品，其灵敏度高于Bradford 法和Lowry 法等分光光度方法，也高于280nm吸光光度法. 与Bradford 法比较，NanoOrange受不同蛋白影响更小。