hth网页入口

注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。

文章导读

2023年1月11日，美国俄勒冈州立大学Gaurav Sahay作为通讯作者，在Science子刊Science Advances（IF: 14.9）发表文章《Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates》。研究者设计了一种肽-LNP偶联物，利用肽的向导作用，可突破LNP的生物学屏障，成功将mRNA递送至动物模型的光感细胞，该技术的发现有望推进遗传性视网膜疾病的治疗进展。

菌菌上期对Gaurav Sahay的文章进行了详细解读，或许可以为组织靶向性递送系统的开发提供思路。感兴趣的小伙伴可以戳链接查看：Science子刊新进展肽偶联LNP将mRNA靶向递送至光感细胞

无独有偶，另一科研团队也于近期发表了靶向性递送系统的开发方案。2022年12月18日，葡萄牙科英布拉大学Vítor Francisco和Lino Ferreira作为共同通讯作者在Advanced Science（IF: 17.5）发表文章：《A Polymeric Nanoparticle Formulation for Targeted mRNA Delivery to Fibroblasts》，这项研究采用高通量筛选的方法，无需添加靶向性配体，从152种聚合物文库中鉴定了6种成纤维细胞靶向性的聚合物纳米颗粒，随后通过体内试验证明了最高效的复合物配方P1E28。该研究也是靶向性递送开发过程中的重要进展，为大家提供一种快速、可行的筛选思路。菌菌在下文中详细解读了这项研究，包括聚合物的高通量筛选、聚合物纳米颗粒靶向递送的体外验证、聚合物纳米颗粒靶向递送的体内验证。

一、聚合物的高通量筛选

1.1聚合物文库的构建

聚合物纳米颗粒具有更丰富的化学多功能性，是mRNA递送的一种有力候选物质。作者假设可以通过特定单体的组合实现聚合物纳米颗粒的细胞和组织靶向性，而不需要添加靶向性配体。

基于以上设想，作者首先制备了聚合物文库，将疏水性双丙烯酸酯（P1）与不同性质的双丙烯酰胺（A-E）和胺（1-32），分别以1: 1: 2的摩尔比分散在二甲基亚砜（DMSO）中。然后使用对应的胺类物质将三元共聚物封端。160种三元聚合物由其组成单体描述，例如，由二丙烯酸酯P1、双丙烯酰胺A和胺1构成的聚合物缩写为P1A01。由于8种组合物发生凝胶化而无法形成，最终构建了包含152种聚合物的文库用于筛选。

1.2 聚合物的高通量筛选

使用不同的聚合物包封Cre mRNA，转染至SFr细胞（小鼠成纤维细胞），通过检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达验证纳米聚合物是否能将mRNA转染至成纤维细胞。

星耀小TIP：

研究使用了来自SC-1小鼠成纤维细胞的SFr细胞进行筛选，SFr细胞是逆转录病毒介导的SF91-loxP1-RFP-loxP2-eGFP稳转株。将mRNA递送到SFr细胞并成功表达Cre重组酶，Cre酶切除loxP侧翼的STOP盒，激活GFP基因的表达。

初筛：作者将聚合物与Cre mRNA以100: 1的质量比混合，制备得到纳米颗粒。将纳米颗粒转至SFr细胞，在96孔板中进行高通量筛选，通过高内涵成像分析转染效率和细胞毒性。研究使用了脂质体Lipofectamine 2000作为阳性对照。结果显示，首先筛选到52种无细胞毒性且转染效率高于裸mRNA的制剂，进一步筛选发现2种非细胞毒性制剂与商业化脂质体转染效率相当（P1C06和P1A05），同样有4种聚合物配方显著激活GFP的表达（P1E28、P1E04、P1C05和P1A04）。因此作者筛选了6种具有相同化学特征的聚合物配方，大多由双丙烯酸酯、胺4/5/6与双丙烯酰胺A/C/E组成。这类的烷基胺类在生理pH下易发生质子化，从而赋予聚合物高阳离子电荷密度，这可以改善mRNA的静电络合和纳米颗粒的摄取。而P1E28不同于其他聚合物，结合了双丙烯酰胺E，并掺入了烷基醇侧链，两个叔胺的哌嗪环赋予聚合物高缓冲能力。

图1 聚合物纳米颗粒的高通量筛选

复筛：作者制备得到不同的聚合物纳米颗粒后，通过透析纯化去除可能影响验证结果的游离mRNA和短聚合物，进一步验证候选聚合物的转染效率。结果发现，不同聚合物诱导的重组活性由高到低依次是：P1E28、Lipofectamine 2000、P1A05、P1A04、P1C06、P1E04和P1C05。P1E28聚合物诱导成纤维细胞中的细胞重组优于商业化脂质体Lipofectamine 2000，且经过4批次的制备，发现各批次间P1E28的性能一致。以上6种候选聚合物均用于后续的体内和体外验证。

小结：研究将不同的聚合物配方转染至SFr细胞模型，通过96孔板进行高通量初筛，最终得到无细胞毒性、且6种聚合物配方。随后经过纯化-转化复筛，验证了6种候选配方的递送效率，因此将6种聚合物配方用于候选的体内外验证。

图2 高转染效率聚合物的复筛

二、聚合物介导的mRNA体外递送验证

作者首先以GFP作为报告基因验证聚合物的递送效率。使用P1E28与其他5种候选物包封GFP mRNA，转染至人皮肤成纤维细胞AG08468、内皮细胞HUVEC、角质形成细胞HaCaT和巨噬细胞THP-1，定量分析表达GFP的细胞数量，基于此评估转染效率。结果显示，在4种测试细胞类型中，P1E28在诱导GFP方面优于其他聚合物，且仅有P1E28对于人皮肤成纤维细胞的转染效率高于内皮细胞、角质形成细胞和巨噬细胞，表明其对成纤维细胞具有偏向性。

随后又借助Cas9 mRNA验证聚合物的递送效率。首先将Cre重组酶转染SFr细胞，制备得到表达GFP的稳转株（SFr-GFP）。随后将包封Cas9 mRNA和向导RNA的聚合物转染至转染SFr-GFP 细胞，定向敲除GFP，通过高内涵成像评估GFP敲除效果，以表示聚合物对Cas9 mRNA和靶向GFP的sgRNA的递送效率。结果显示，转染3天后，P1E28介导转染均导致细胞中的GFP表达降低；转染10天后通过流式细胞仪验证其长期效果，6种聚合物配方均导致转染细胞中GFP表达下降，但仅有P1E28相比对照组增加了GFP阴性的丰度。P1E28为Cas9 mRNA和sgRNA共递送的最佳聚合物配方，且优于共转染试剂DharmaFECT Duo。

关于mRNA研究用报告基因，耀海生物重磅推出预制型mRNA_mCherry-eGFP（双报告基因串联表达型）、mRNA_eGFP、mRNA_mCherry、mRNA_luciferase及基因编辑用mRNA_Cas9。耀海团队严格把控mRNA预制品的质量和表达活性，制备得到的mRNA纯度可达97%以上，体外试验中均检测到目的蛋白的表达信号，高质量满足体内外试验需求。

小结：作者通过两项体外试验验证了聚合物配方P1E28可将mRNA递送至成纤维细胞。第一项研究使用聚合物将GFP mRNA转染至人纤维细胞和其他类型的细胞，验证了P1E28对人皮肤成纤维细胞具有偏向性。第二项体外验证试验试验P1E28将Cas9 mRNA和向导RNA共同递送至小鼠成纤维细胞，检测到靶基因GFP的表达降低。两项研究共同证明了P1E28是一种潜在的成纤维细胞靶向性聚合物配方。

图3 聚合物配方介导的mRNA细胞转染试验

三、聚合物介导的mRNA体内递送验证

作者以R26-tdTomato小鼠为体内试验研究对象，验证聚合物配方的体内靶向性递送效果。

星耀小TIP：

R26-tdTomato小鼠该模型与筛选过程中使用的SFr细胞类似，包含一个loxP侧翼的STOP盒，可以通过Cre重组酶切除，从而导致荧光蛋白tdTomato的表达。

首先在麻醉情况下通过无菌活检打孔造成两个直径6mm的切除伤口，两个伤口距离控制为5cm，期间进行镇痛治疗，作为诱导的皮肤损伤小鼠。受伤后5天，将P1E28-Cre mRNA皮内注射至小鼠，使用商品化脂质体Lipofectamine 2000作为对照组。注射后7天采集皮肤切片用于分析tdTomato表达水平。

小鼠体内试验显示，P1E28递送系统诱导的tdTomato荧光信号显著高于Lipofectamine 2000（5.5倍）。利用细胞特异性表达蛋白进行免疫组化分析，结果显示，P1E28-Cre mRNA诱导的tdTomato表达区域与α-SMA+成纤维细胞共定位，而在内皮细胞（CD31）、角质形成细胞（Krt5）和巨噬细胞（CD68）中共定位效果不佳，提示P1E28对成纤维细胞的偏好性。随后进行了机制分析，表面P1E28聚合物纳米颗粒通过靶向CD26和FAP受体将mRNA特异性递送到成纤维细胞。

小结：这项小鼠模型结果显示，基于聚合物配方P1E28，可将Cre mRNA递送至成纤维细胞，且递送效率高于内皮细胞、角质形成细胞和巨噬细胞。机制分析结果表面，P1E28通过靶向CD26和FAP受体将mRNA优先递送到成纤维细胞。

图4 聚合物介导的mRNA体内递送验证

四、展望

成纤维细胞对于多种疾病的发生至关重要，包括皮肤纤维化、肝脏纤维化、肺纤维化、心脏纤维化以及自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和克罗恩病等。Vítor Francisco等开展的这项研究首次报道了成纤维细胞靶向性的纳米制剂，同时不需添加特定的靶向性配体，将推动纤维化疾病与自身免疫性疾病的药物开发进程。

另外，研究通过机制分析发现，CD26和FAP有助于成纤维细胞摄取聚合物纳米颗粒，为mRNA靶向递送至成纤维细胞提供了重要靶点，同时对于成纤维细胞靶向性制剂配方的开发方法具有重要的参考意义，可能涉及：纤维细胞靶向性制剂配方的筛选或配体的开发，以及配方开发过程中的体外验证等。

参考文献

[1] Rodrigues AF, Rebelo C, Simões S, Paulo C, Pinho S, Francisco V, Ferreira L. A Polymeric Nanoparticle Formulation for Targeted mRNA Delivery to Fibroblasts. Adv Sci (Weinh). 2022 Dec 18:e2205475. doi: 10.1002/advs.202205475.

推荐阅读

【星耀小课堂】一文全知道︱三分钟告诉你新冠抗原检测原理

【耀文解读】面对Omicron亚型变异株，新冠mRNA疫苗加强针接种策略

【耀文解读】探究“波士顿大学合成新冠病毒，致死率达80%”标题党背后的真相

【耀文解读】新冠解法再添新丁，cricRNA技术抗击新冠科研成果解读

【耀文解读】新冠病毒密码子适应性演化及对mRNA疫苗序列优化的启迪

耀海生物服务覆盖 “重组蛋白/疫苗，质粒/mRNA、纳米抗体”等领域pre-IND至临床Ⅲ期样品制备及商业化生产服务，致力于打造CRO/CDMO/MAH全方位，定制化一站式服务平台。拥有20000平符合GMP要求车间，3000平研发中心，针对客户需求提供50L-2000L定制化服务。相关资讯请联系官方客服耀菌君联系：13380332910（微信同号）