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分离纯化：基因工程菌重组蛋白表达中包涵体蛋白的纯化及复性

一、包涵体的定义、组成与特性

1、包涵体的定义与组成

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。

2、包涵体的特点

（1）固体颗粒（2）混合物（3）非水溶性颗粒，大小: 0.2-1.5um；密度: 1.3mg/ml （4）细菌表达的重组蛋白（5）溶于变性剂(尿素、盐酸肌)

二、包涵体蛋白形成的原因

包涵体的形成主要因为在重组蛋白的表达过程缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法成正确的次级键等原因造成的。相关因素如下:

1)表达量过高

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2)重组蛋白的氨基酸组成

一般说含硫氨基酸和脯氨酸越多越易形成包涵体，而氨基酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3)重组蛋白所处的环境

发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白

由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

以包涵体形式表达也有有利的因素: 1)可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解; 2)降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高; 3)包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性，蛋白分离，有利于分离纯化; 4)对机械搅拌和超声破.碎不敏感，易于粘壁，并与细胞膜碎片分离。

三、表达中如何减少包涵体蛋白的形成

减少包涵体形成的策略如下：

1降低重组菌的生长温度

降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。

2添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂

培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇(诱导热休克蛋白的表达)、低分子量的疏基或二硫化合物(影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成)

3供给丰富的华体会体育最新地址，创造最佳培养条件

如供氧、pH等。防止包涵体常用的方法:使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化华体会体育最新地址条件，进行融合表达，与伴侣分子和折叠酶共表达，表达定位于不同的空间，选择突变的菌株或其他的原核表达系统。

4表达调控

（1）表达调控（2）基因序列优化（3）共表达（4）表达微调控

四、包涵体的溶解

变性剂盐酸胍/尿素是包涵体常用的溶解试剂，通常还会加入一些去污剂(NLS、CTAB、SDS) 和还原剂(巯基乙醇、二硫苏糖醇等)。它们通过改变蛋白质的结构，打开蛋白质肽链。由于包涵体是部分折叠蛋白质聚集而成的具有天然或天然样构象的二级结构。如在适合的条件下将其溶解变性，这些天然样构象的二级结构将不被破坏而保留，这样将更利于复性工艺中的蛋白质回收。部分学者认为，高浓度的变性剂（盐酸胍等）能够完全破坏掉蛋白质的天然结构。因此，要保留天然的二级结构必须采用温和的溶解方法。例如，应用低浓度的尿素对包涵体进行温和处理，可保留目标蛋白的少量二级结构。

五、包涵体蛋白的复性

1、原理

通过缓慢去除变性剂(避免折叠中间体重新聚集)使目标蛋白从变性的完全伸尾状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。

2、影响包涵体蛋白复性的因素

蛋白质复性是一个非常复杂的过程，除与复性过程中有关的操作条件或环境因素有关外，在很大程度上还与蛋白质本身的性质有关，复性过程的关键是控制好条件，不使蛋白分子形成无活性的聚集体，而使蛋白分子内的次级键与二硫键能正确形成，进而折叠成特有的空间结构。下面简要介绍影响蛋白质复性的主要因素。

2.1变性蛋白的情况

变性蛋白分子内不应存在二硫键，如果在蛋白变性溶解过程中没有控制好还原剂的加入量而使二硫键彻底还原，将会使蛋白复性效率下降。

2.2蛋白质的质量浓度

正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用所造成的，蛋白质的质量浓度是使蛋白质聚集的主要因素。质量浓度大时，分子间距离较短，相互间容易作用而结合，形成沉淀，故复性时蛋白质质量浓度宜低;蛋白质质量浓度小时，获得的蛋白质复性效率比质量浓度大时要好得多，但过小又给后处理带来不便，一般选择其质量浓度为0.01~0.1 mg/ mL ，以促进分子内相互作用，避免分子间相互作用引起聚集。

2.3 pH值复性

缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般为8.0~9.0，选择pH值，应避免在蛋白质等电点处进行复性。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，静电排斥力几乎为零，相互间疏水作用区域就容易发生作用而形成聚集体。

2.4氧化还原电势较好地控制

氧化还原电势对于形成正确的二硫键非常必要。氧化还原电势过小，不容易形成二硫键;氧化还原电势过高，蛋白间易形成二硫键，使二硫键发生错配。常用的控制方法有空气氧化法、氧化还原电对法。

2.5复性添加剂

蛋白稳定进剂糖类、甘油、盐类等折叠促进剂分子伴侣、环糊精等聚集抑制剂精氨酸、脲、盐酸肌、表面活性剂等

2.6杂质的含量

杂蛋白在变性剂溶液中也是以变性状态存在的，杂蛋白与重组蛋白一起复性时可形成杂交分子而聚集，故复性时要求目标蛋白具有一定的纯度

2.7 变性剂移除(或稀释)速度

变性剂移除(或稀释)速度过快，会使变性蛋白单体之间迅速聚集，形成无活性的聚集体;相反，适当降低变性剂移除(或稀释)速度，则有助于蛋白进行特定空间结构的折叠，形成活性蛋白。

2.8蛋白自身结构

有些蛋白空间结构复杂，分子间次级键数量多且复杂，不易形成正确配对，因此需要足够长的时间进行空间结构的构成，如果不提供足够长的复性时间及控制复性速度，将很难得到有活性的蛋白。

2.9温度

温度升高可提高蛋白质复性速率，但也会造成蛋白分子间次级键和二硫键的错误配对，引起空间结构变化。另外，温度升高也会引起蛋白分子间的聚集，生成无活性的蛋白聚集体，通常复性温度要求常温或较低的温度范围2.10 前体肽在复性过程中加入前体肽，有助于蛋白分子的正确折叠，生成有活性的蛋白分子，前体肽在蛋白折叠过程中起到了一个分子内伴侣的作用。具有前体肽助折叠机制的有各种蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶

3、包涵体蛋白复性的工艺设计

1对目的蛋白一级结构的了解氨基酸序列，半胱氨酸/胱氨酸含量，二硫键，脯氨酸占的比例等

2对目的蛋白的特性如标签，特性如DNA聚合酶的活性需Mg离子辅助

3·处理量，结果导向要明确

4，确定添加剂

5确定复性方法如稀释配合离子交换柱上复性

5、复性方法比较