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导读： 2022年9月5日，英国伦敦大学Marco P. C. Marques^[¹^]作为通讯作者，在Biotechnol Bioeng发表文章《Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization》。该文章介绍了一种机器学习方法——Bayesian优化，其作为实验设计（DoE）的一种形式可以将mRNA产量提高两倍。在这项研究中，Bayesian优化仅在60次实验运行中发现了最佳反应条件，产生12 g·L⁻¹mRNA只需2小时。

由于近年来mRNA疫苗技术的兴起，人们对在诊断和治疗应用中使用mRNA疫苗的兴趣日益浓厚。mRNA疫苗是在由RNA聚合酶催化的体外转录（IVT）中产生的，产量通常为2-5g·L⁻¹。由于高效且具有成本效益的生产工艺对于大规模生产和疫苗供应链至关重要，因此IVT反应条件优化越来越重要。传统的优化方法依赖于经典的DoE方法，这些方法非常耗时，并且可能呈现人为偏见或基于简化的假设。本研究采用 Bayesian 优化可实现实验设计自动化，提供反馈循环。 在60次运行中发现了最佳反应条件（在两小时内产生12 g·L^-1），优于已公布的行业标准。 这些结果增强了Bayesian优化在工业应用中优化生物化学反应的潜力。

Bayesian优化

Bayesian优化有两个主要组成部分： 代理模型 和 采集函数 。代理模型模拟正在优化的未知函数，同时在计算上进行评估。用每个新的测量值更新先验分布，以产生更准确的后验分布。采集函数基于代理模型的平均值（μ）和标准差（σ）。以下要评估的点由采集函数确定，例如可以计算当前最佳结果的最大预期改进（EI）。实验设计挑战并非mRNA生产所独有，尤其是IVT反应。设计问题在科学和工业环境中都普遍存在。 Bayesian 优化的出现为合成化学或机器学习等领域的各种设计问题提供了强大的方法论。

IVT优化工作流程

简而言之，在IVT反应中，RNA聚合酶以DNA模板、核苷三磷酸（NTP）为底物合成互补RNA分子。在这项研究中，确定了12个可能影响反应结果的反应参数：酶活性（T7 RNA聚合酶和无机磷酸酶）；核糖核酸酶抑制剂、DNA模板、NTP、亚精胺和二硫苏糖醇（DTT）的浓度；辅助因子的类型及其浓度（例如醋酸镁与氯化镁）；反应pH、温度和反应时间（表1）。反应和工艺参数汇总见表1。

表1 IVT参数和评价指标

将模型建议的每次实验运行中获得的mRNA浓度输入Bayesian优化器，初始反应条件随机化。在每个实施的优化周期中，根据过程的模型知识（即要产生的最大量mRNA）更新模型并提出新的实验条件（图1a）。具体优化流程按如下方式进行：

1.使用协方差函数初始化高斯过程（GP）代理模型。

2.为代理模型选择一批随机初始反应条件，这些条件取自拉丁超立方抽样（LHS）设计。

3.进行初始实验，并分析mRNA产量。

4.使用经过评估的mRNA反应条件模型，构建后验分布。

5.基于代理模型计算、获取函数及其最大值，用于优化后续反应条件（图1b）。

6.重复步骤4和5，直到满足选定的收敛标准。

图1 mRNA IVT反应的Bayesian优化

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优化分析

可以通过多种方式跟踪优化过程的进度。可以借助平行坐标图对反应参数空间进行探索（图1c）。该图概述了整个优化过程中可能的最佳反应参数范围。随着时间的推移，还会评估最佳反应条件，用于确定优化周期中是否取得了重大进展。通过分析整个优化实验的平行坐标图，可以观察到当 醋酸镁浓度在40-70 mM之间，NTPs浓度在7 mM以上，亚精胺浓度在1-3 mM，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的体积活性在6000-8000U·mL⁻¹，反应温度在37-45°C，初始pH值低于7.5 时，可获得最佳mRNA产量。在优化程序的前60次运行中发现了产生最大量mRNA的反应条件（图1d）。获得的几种反应条件，产量均超过10 g_mRNA· L⁻¹。

为了更好地理解IVT反应条件优化，本研究使用了两种不同的机制。首先，将预期mRNA IVT产量和模型预测与反应经验评估进行比较。其次，为GP代理模型构建了解释模型（图1e，f）。结合这些机制对坐标图进行评估，可以推断特定参数对代理模型预测的影响。 pH值对反应结果有很高的影响（积极的），特别是在6.5-7.5之间。 其次是辅因子浓度，最佳范围设置在40-60 mM 之间。高无机焦磷酸酶和DTT浓度对反应产生积极影响。对于较高浓度的DNA和NTPs（分别高于40 nM和7 mM），也观察到这一点。T7 RNAP的存在会影响模型，但在较低的酶体积活性下，在6000和8000 U·mL⁻¹之间，最终将产生更多的mRNA。令人惊讶的是， 高亚精胺浓度会对模型产生负面影响 ，最佳值在1-3 mM范围内（图1c，e，f）。

IVT动力学

在进行的实验中，反应时间没有明确优化。然而，根据反应曲线评估了超过10.7 g_mRNA·L⁻¹的六种最佳反应条件（表2）。将这些反应与Moderna专利中列出的反应参数相对应的基准反应条件进行了比较，这导致预期的mRNA产量为5 g ·L⁻¹。

表2 与基准反应条件（反应7）相比，Bayesian优化后最佳反应条件下（反应1-6）的mRNA生产反应参数和mRNA浓度

为了获得反应曲线，在5小时内取样（图2a）。 优化过程中发现所有的反应都优于基准反应，产生至少10 g_mRNA· L⁻¹的mRNA。 尽管在优化运行期间，反应1和4产生的mRNA量最高，但反应5在2 时后在更短的时间内实现了最高的产量，对应于10.65 ± 0.01 g_mRNA· L⁻¹的最终浓度（图2b）。还通过琼脂糖凝胶电泳（图2c）和HPLC分析评估产生的mRNA质量。 约115分钟后，未检测到mRNA量的显著变化，确认反应性能在2小时标记处达到峰值。 观察到第二条带在115分钟后增加，这可能对应于反应副产物，例如双链mRNA（dsmRNA）或异常mRNA。HPLC分析表明，在反应完成，dsRNA/RNA_total之比为0.05±0.0033 mg · mg⁻¹。

图2 mRNA生产分析

IVT性能验证

为了验证优化的反应性能，本研究比较了使用不同大小模板的mRNA产量。含有EGFP基因的模板，Covid-19受体结合结构融合到EGFP（RDB_EGFP），Cas9基因也融合到EGFP（Cas9_EGFP），分别为1195、1864和5299 bp。研究了反应曲线（图2d）和2小时后产生的总mRNA浓度之间的差异（图2e）。 改变模板的大小不会对使用条件优化的反应结果产生影响。所有评估的模板大小均产生超过10 g·L⁻¹的mRNA。 然而，对于较大的模板，mRNA浓度倾向于从9.7±0.29 g·L⁻¹（反应时间145分钟）降低到7.1±0.19 g·L⁻¹（反应结束）。尽管浓度减少，在反应时间的2小时内仍然产生10 g_mRNA· L⁻¹。

最佳IVT生产条件比较

将最高mRNA产生反应条件与文献和专利中报道的不同反应条件进行比较（图2f）。 在反应时间的2小时内，获得了12g_mRNA· L⁻¹的总量，超过基准反应2倍（表2）。

总结

由于近年来mRNA疫苗技术的兴起，IVT反应优化变得越来越重要。然而，现有的优化实验集中在反应建模上或DoE方法论。优化方法仅考虑对小参数空间的探索，并且通常假设反应参数之间的关系由预先建立的酶动力学模型给出。本研究证明了Bayesian优化方法在应用于IVT生产mRNA时的有效性。IVT是一种依赖于12种不同反应参数的多组分反应。使用这种方法，仅在60次实验运行中发现了mRNA的最佳生产条件。

总体而言， 通过使用Bayesian优化能够在不到两小时将mRNA IVT产量提高两倍，高达12 g_mRNA· L⁻¹ 。事实证明，这种优化方法具有成本效益，因为它只需要60个反应即可实现最佳参数组合。所获得的结果有可能提高mRNA疫苗的全球生产能力并增强Bayesian优化在工业应用中优化生物化学反应的潜力。

参考文献

[1] ROSA S S, NUNES D, ANTUNES L, et al. Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization [J]. Biotechnology and bioengineering, 2022, 119(11): 3127-39.

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