4细胞外周质表达和分泌表达

（1）细胞外周质表达

在外周质只有4%的总细胞蛋白，这显然有利于目的蛋白的纯化，外周质的氧化环境有利于二硫键的形成，使蛋白质正确折叠，而胞内则是还原性的环境。H质空间有h叠酶DsbA和DsbC，可以帮助蛋白质的正确折叠，且很少有蛋白酶存在，目的蛋白不会被水解，对细胞有毒性的蛋白可大量存在。

蛋白质通过内膜转运到外周质需要信号肽，在起始密码子和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态，不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。

将蛋白质分泌到细胞外易于纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。要解决蛋白质外泌方面的难题，必须弄清E.coli的分泌途径。在E.coli中将蛋白质分泌到华体会体育最新地址 中的方法大致分为两类：1利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途； 2信号列融合伴侣和具有穿透能力的因子。第一种方法具有将目的蛋白质特异性分泌的优点，并最小限度地减少了非目的蛋白的污染。第二种方法依赖于有限渗透的诱导而导致蛋白质的分泌。通常情况下，外泌蛋白质的产量是中等的。

目前已有多种用于大肠杆菌系统的表达载体，从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，可选用pET-21 (+) 、pET-24 (+)等载体。如果打算利用载体的起始密码子，那么就有更多的选择。亦可根据是否要可溶性表达，选择加有不司标记的载体。一般说来，在大肠杆菌中不加标记，外源蛋白都会以不溶的包含体形式表达。为了让外源蛋白融合表达，一般说来有三个策略： ①与一个高度可溶的多肽联合在一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶(glutathione Stransferase， GST) 、硫氧还蛋白(thioredoxin， Trx) 。②转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白、DsbA。 DsbC。③插入一个定位到周质空间的信号序列。不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。如果不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，可以直接从起始密码子后插入外源片·段，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。

表达双外源蛋白的载体有pCDFDuet-1 DNA， pETDuetTM-1DNA， pRSFDuet-1 DNA。这些载体含有两个不同的多克隆位点，可以插入两个外源蛋白基因，利用单独的T7启动子、乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达8个外源蛋白。

质粒上的元件包括启动子、多克隆位点、终止密码子、融合Tag (如果有的话)、复制子、筛选标记/报告基因等，在进行表达工作之前要做充分的分析，以确认所选载体是否合适。通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是以严谨方式复制的，拷贝数低， pCoE1， pMBI (pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素次之，而四环素、红霉素和氯霉素等已经很少使用。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。

启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一，能在E.coli中发挥作用的启动子很多。这些启动子必须具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。首先启动子的作用要强，待表达基因的产物要占或超过菌总蛋白的10%~30%；其次，它必须表现最低水平的基础转录活性。若要求大量的基因表达，最好选用高密度培养细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。如果所表达的蛋白质具有毒性或限制宿主细胞的生长，选用可抑制的启动子则至关重要。

转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用--控制转录的RNA长度以提高稳定性，避免质粒上的异常表达导致质粒的稳定性下降。在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。

在原核生物中，转录终止有两种不同的机制，一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离。另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区和位于该回文序列下游4~9bp处的dA， dT富含区。