一、柠檬酸发酵菌株及其代谢途径

1、柠檬酸发酵菌种

菌种在自然界中，能够积累和分泌柠檬酸的微生物很多，包括黑曲霉、温氏曲霉、梨形毛霉、淡黄青霉等。当今柠檬酸大规模生产中多采用黑曲霉和温氏曲霉菌株，因为，它们产量高，而且能够利用多种碳源。

多种类型的微生物可以用于生产柠檬酸，如曲霉类--Aspergillus niger，A. awamori，Penicillium janthinelum；酵母类-Yarrowia lipolytica，Candida tropicalis，Candida oleophila；及细菌类--Bacillus licheniformis，Arthrobacter paraffinens，Corynebacterium sp. 。酵母类可以利用不同类型碳源生产柠檬酸，其中解脂亚罗酵母已经被广泛用于生产柠檬酸，利用解脂假丝酵母发酵烷烃类底物，获得大量柠檬酸。然而，柠檬酸是能量代谢产物，仅在代谢不平衡条件下才能大量积累，虽然文献，报道多种类型微生物可以生产柠檬酸，可用于工业化生产仅曲霉类与酵母类。酵母类发酵会产生大量的副产物异柠檬酸，降低柠檬酸产量。因此，筛选低顺乌头酸酶活性的突变株或许有助于提高柠檬酸产量。黑曲霉易操作，底物广泛，产量高，副产物少，是柠檬酸工业化生产的最佳选择。

2、柠檬酸发酵代谢途径

二、柠檬酸发酵方式

柠檬酸发酵方式包括浅盘发酵法( surface fermentation)、固态发酵法( solid fermentation )、液态深层发酵法(submerged fermentation)3种形式。浅盘发酵又称表面发酵，是柠檬酸发酵最初的发酵形式；固态发酵方式能够利用工农业加工废料，降低生产成本，同时减少环境污染，是一种非常具有潜力的发酵模式，但因废料成分复杂，对发酵后期产物提取影响较大，有待于进一步研究；液态深层发酵方式具有产率高，自动化程度高，不易污染，发酵周期短等优势，是柠檬酸工业化生产的主要方式，约有80%的柠檬酸产量是通过液态深层分批发酵方式得到的传统分批发酵模式严重制约了柠檬酸的快速增长，对于工业化生产，连续发酵方式更具有优势，消耗少的劳动力获得较高的发酵效率，学者始终未停止对柠檬酸连续发酵工艺的探索。然而柠檬酸合成是部分生长偶联型，且黑曲霉菌丝体结构复杂，实现黑曲霉连续发酵生产柠檬酸比较困难

1、表面发酵

表面发酵是利用生长在液体华体会体育最新地址 表面的微生物的代谢作用，原料转化为柠檬酸的发酵方式。

2、固体发酵

固体发酵是将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式。固体发酵又有薄层发酵法和厚层通风发酵法之分。

（1）薄层发酵法 固体发酵过程，对温度和湿度的控制非常重要。

①温度的控制 室温调节，使用制冷设备或在地上洒水，加大通风量。但加大通风量时，要防止水分蒸发太多，影响产酸。

②湿度控制 低温季节直接通蒸汽，高温季节在地上洒水。但湿度太大的时候易生毛霉，所以发现毛霉污染的时候不能再加大湿度。

③发酵过程是否正常的判断观察菌丝的长势，接种20h可见白色菌丝变成黄色， 36h可见细小灰白色孢子头，孢子梗长达2mm， 48h孢子转为棕色，以后色度逐渐增加。曲酪在发酵过程中逐渐收缩，紧密结块。

④发酵终点判断 出曲时间由产酸决定。培养48h开始测定，每12h测一次。72h后每4h测一次，在酸度最高时出料，否则时间拉长柠檬酸反而被菌体分解。如果出现杂菌污染时，应根据杂菌的污染情况提前出曲。

(2)厚层通风发酵法

在薄层发酵的基础上建立起来的，特点是：必须由容器的假底向上通风，以供给氧气和带走热量，机械化程度提高。这种工艺目前仍在日本占主要地位， 日本主要在设备方面进行了改进，实现了发酵密闭化、操作机械化和部分自动化。

厚层发酵的重要控制仍然是温度和湿度：温度的控制与薄层发酵相似；湿度的控制主要是通风量和进风湿度(相对湿度接近100%) 。

厚层发酵曲层更加疏松，保证通风，防止水分蒸发。曲层厚度在20cm以下时无需翻料，否则一般都配有翻料装置。厚层发酵的产酸率、产酸浓度、发酵时间与薄层法相似，但它的主要优点是设备占地面积小，污染的可能性较小，机械化程度高，能够形成较大的生产规模。

3、深层发酵

深层发酵是菌体在液体华体会体育最新地址 中，在通气的条件下通过代谢转化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。当产酸不再升高、残糖降至0.2%以下时，终止发酵，立即进入提取。

液态深层发酵技术要点如下：

（1）碳源种类： 薯干粉、木薯粉、玉米粉、大米粉、小麦粉、马铃薯、淀粉等的液化物，糖蜜，葡萄糖及葡萄糖母液

（2）碳源浓度 150gL-200gL

（3）氮源种类 除原料中含有的有机氮外，使用铵盐(硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二氨、尿素等生理酸性氮源)

（4）氮源浓度 适量调节(防止过量菌体生长)当采用玉米粉液化液时，控制发酵华体会体育最新地址 蛋白质含量0.4%以下

（5）磷酸盐 原料中含的磷酸盐已满足发酵需要，不另添加也不控制

（6）金属盐 不限制接种后发

（7）酵初始的pH值为4.0以下；当柠檬酸生产时，pH华体会体育最新地址 pH值 值下降为1.5-2.0

（8）通气(供氧) 供给过量的氧(充足通气是必要的)搅拌要避免菌丝的剪切和过度的冲击

（9）接种量 >10%

华体会体育最新地址 灭菌 105℃C、10min-20min或采用空罐灭菌直接打入除渣玉米液化液。

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