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大肠杆菌（一）

认识大肠杆菌

大肠杆菌（Escherichia coli），又叫大肠埃希氏菌，Escherich在1885年发现的。大肠杆菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。大肠杆菌是较为普通的原核微生物，是人类和大部分温血生物肠道中的正常菌群，为条件致病菌。大肠杆菌为兼性厌氧菌，化能异样型。有氧条件下进行有氧呼吸，无氧条件下可进行无氧发酵产能，维持生存。

从细胞结构进行了解，大肠杆菌为单细胞的原核微生物，遗传物质主要存在于无核膜包被的细胞核（亦称拟核）中。细胞内部没有具有膜结构的细胞器（诸如线粒体、叶绿体等）。根据细胞壁的结构分类，属于革兰氏阴性菌。为0.5-0.8um*1.0-3.0um的两端钝圆的短杆形状，周身鞭毛可运动。不同生长条件下细胞形态存有差异。

细胞壁为于细胞最外层，厚度11nm，外膜和肽聚糖两层。外膜为细胞壁的主要成分（80%），8nm厚度，磷脂、蛋白质、脂多糖为主要构成成分。大肠杆菌的肽聚糖由聚糖链、短肽和肽桥三部分组成。由脂蛋白将外膜和肽聚糖层连接起来，从而使大肠杆菌的细胞壁形成一个整体结构。外膜中的脂多糖为内毒素，为生产环节的常规去除成分及检测项。

大肠杆菌细胞膜的结构和其它生物细胞膜的结构相似。但其细胞膜中蛋白质的含量高且种类多。其细胞膜具选择透性，从而可控制营养物质进出细胞。细胞膜是原核生物能量转化的场所，并能通过它对外界环境的各种刺激作出反应，并可传递信息，参与细胞壁的合成等。

细胞质是细菌的内环境，是蛋白质、各种酶类和核酸生物合成的场所，也是吸收营养物质后进行物质合成和分解代谢的场所。大肠杆菌的细胞质中含有糖原颗粒、核糖体和质粒等结构。

核糖体是细胞质中一种核糖核蛋白颗粒，是蛋白质合成的场所。大肠杆菌的核糖体呈椭圆球形，体积为13.5nm×20nm×40um。由65％的核糖核酸和35％的蛋白质组成。大肠杆菌的核糖体分散在细胞质中，完整核糖体的沉降系数为70S，由30S和50S两个大小不同的亚基组成。

在大肠杆菌中，除遗传物质的主要载体染色体之外，还有一种闭合环状的双链DNA遗传因子，即质粒。

质粒具有自我复制的特性，不同质粒的基因及质粒和染色体基因均可发生基因重组，质粒可通过细菌的接合而转移，也可随细胞的分裂而传递或丢失。大肠杆菌中已发现的质粒有F因子、R因子和Col因子等。

大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结构简单，称为拟核，也称细菌染色体。拟核具有高度紧密的结构，由RNA、蛋白质和超螺旋环状DNA组成。

大肠杆菌的全部基因都包含在这条DNA上。通过研究大肠杆菌基因的结构、功能及表达调控可揭示其它生物的遗传现象和规律。

大肠杆菌（二）

利用大肠杆菌

大肠杆菌为研究和工业生产中普遍运用的最基础的模式菌株之一。最常见的有JM109、DH5α、BL21系列等。由于大肠杆菌遗传背景清晰，人工改造成熟多样性和安全性都意味着其在研究和工业生产中的广泛应用。

作为外源基因表达宿主，原始野生型菌株通过不断的筛选改造，失去细胞壁的重要成分，降低或者完全失去毒性。可放心用于分子克隆和目的基因的表达，例如载体构建、噬菌体展示、小分子蛋白质表达，乙醇或大宗化学品的生产等。目前大肠杆菌在医药行业工业生产方向，主要用于蛋白的表达，其中以胰岛素的包涵体表达为代表性。

胰岛素的分子结构简单，分为A、B链，而大肠杆菌作为原核表达工程菌株用于简单结构多肽蛋白的表达具有明显的优势。以甘李药业的胰岛素为代表，分子改造后的大肠杆菌可以通过乳糖操纵子操控，IPTG诱导大量表达多肽链。由于诱导期间高效的转录表达，蛋白质的空间结构不正确折叠，蛋白聚集以包涵体形式存在。表达出的包涵体经过发酵液预处理破碎分离，变复性，以及多步的纯化，最终获得胰岛素原液。

大肠杆菌（三）

培养大肠杆菌

在发酵行业，大肠杆菌的发酵工艺较为成熟。一旦蛋白的表达功能确定，在不影响下游提取的前提下，对培养的工艺参数进行优化后，可轻松的转移至CMC及工业大规模的生产。

大肠杆菌的发酵工艺开发过程主要从华体会体育最新地址优化、补料、温度、pH、DO等方面进行。

说到华体会体育最新地址优化，首先想到的是碳氮比。现在大规模发酵大肠杆菌的华体会体育最新地址大部分都源自于M9类似的无机盐基础华体会体育最新地址。医药行业的有机碳氮源主要指葡萄糖、甘油、蛋白胨和酵母粉。由于医药生产原料的来源要求较高，动物来源的蛋白胨通常是不被使用的。碳氮比的使用对生长影响主要表现在碳源过高产酸较多，氮源过高生长旺盛pH升高。因此在补料阶段选取合适的碳氮比直接直接影响到细胞的生长活性和蛋白的表达情况。经验之谈，碳氮比4：1适用于高密度发酵的选择。除碳氮比的探索，初期也可以通过单因素筛选出重要的成分，进而DoE得出最优水平组合。

基因工程改造过的大肠杆菌，副产物水平主要以乙酸为主。也有大部分工程菌敲除了乙酸等副产物代谢途径的关键基因，使得营养到蛋白表达流向更充足。高密度发酵大肠杆菌的时候，对补料的控制较为关键。合适的流加速率可以减少副产物的积累，缩短整个发酵周期，获得较高的生物量。大肠杆菌的比生长速率μ值范围最高不超过0.3。在实际的发酵生产过程中，Fed-batch之前的Batch结束时间主要以DO和pH的突然升高为信号，在此情况下可以观察到尾气分析系统中的CO2分压或者CER有下降趋势。当然在华体会体育最新地址中的残留葡萄糖也可以作为主要参考依据，但根据华体会体育最新地址成分的不同和复杂性，葡萄糖生物传感器测定值可能不会100%能反映出真实残糖。

针对分批补料发酵方式，诱导时机的选择一般在对数生长的末期。诱导期间补料速率基本保持不变。温度和pH主要是和发酵诱导有关。众所周知，大肠杆菌的最适生长条件为37℃、pH7.0。当重组蛋白表达期间，由于转录表达速率和影响空间结构的因素会受到温度和pH的影响，所以对于不同的重组蛋白，最适的表达条件不同。对于希望以包涵体表达的蛋白，可以选择高一些的温度和合适的pH；可溶表达可以适当降低温度进行诱导。诱导时间长度以获得最高目的产物为判断点。一般在获得最高生物量之后4小时左右蛋白的表达水平达到最高。

DO对于大肠杆菌的高密度发酵限制主要表现在发酵对数生长后期和诱导期间。对于高生物量的获得至关重要。按照100%DO溶解氧浓度为6.5mg/L，当DO接近0，有氧呼吸受阻的时候，维持细胞正常生理状态的条件被破坏，会影响到蛋白质的表达。因此维持合适的有效溶解氧可以维持细胞的活力，无菌空气和纯氧的混合通气可以作为后期DO控制的手段。

DO主要受发酵罐性能，发酵液状态KLa值的影响。发酵过程中，非补料影响DO低于设定值的，一般以搅拌、通气、罐压顺序依次进行调节。设备的控制无异常，碳氮比合适，组成不复杂的情况下，当停止补料会观测到DO、pH即刻上升，再次通入补料DO、pH恢复的反馈现象。该情况证明发酵状态良好，但无特殊情况不建议使用。此外当DO出现回升，泡沫增多，pH升高同时伴随着发酵液OD₆₀₀极速下降的情况下可以判断是受到了噬菌体的污染，此时应该及时止损选取对应的解决方式，彻底灭活处理并对环境进行长期消杀。