2022年8月21日，国际学术期刊Molecular Therapy-Nucleic Acids发表了题为“ Double-stranded RNA reduction by chaotropic agents during in vitro transcription of messenger RNA ”的文章 ，该文章提出了一种在IVT反应过程中添加离散剂有效去除IVT副产物dsRNA的新方法。

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dsRNA杂质是mRNA合成过程中产生的副产物，会刺激RIG-I和MDA5等，触发 下游抗病毒天然免疫信号通路，引起免疫反应。作为治疗用药，数十毫克剂量的mRNA，一旦杂质质量控制出现问题，注射入体内后，病人可能出现强烈的不良反应，甚至是生命危险，mRNA合成纯化质控过程至关重要。

dsRNA 的去除很大程度上依赖于IVT 后色谱纯化，例如反向高压液相色谱，增加制造成本，降低产量，并经常降低完整性，特别是对于长 mRNA来说。

* 目前常用的去除dsRNA的方法

• RP-HPLC和羟基磷灰石色谱法，这两种纯化方法也是目前最常用的纯化mRNA原液的方法，这种纯化方式存在以下问题：a）由于柱负载能力有限而限制产能，难以放大；b）纯化过程中mRNA的完整性受影响；c) RP-HPLC工艺中用到的大量有机溶剂也有生产安全隐患。

• 纤维素粉吸附dsRNA的纯化方法，同样面临规模放大困难产能有限的问题，同时mRNA的完整性会有一定程度的降低。

• RNase III消化长片段dsRNA的方法有误伤mRNA本身二级结构的风险，同时增加了额外的去除酶的纯化步骤。

以上这些转录后纯化方法增加了生产成本，降低产量，而且通常会降低mRNA的完整性，尤其是较长的mRNA。因此，研究者开始关注体外转录过程中减少dsRNA副产物的方法。

* 目前通过优化体外转录反应条件去除dsRNA的方法

1.降低Mg²⁺浓度可以减少dsRNA的生成，当Mg²⁺浓度为5mM时，几乎检测不到dsRNA的存在。但是，降低Mg²⁺浓度也严重影响了mRNA的产量。

2.提高反应温度可以减少IVT过程中dsRNA的形成。但在mRNA的大规模生产中，高温对设备的要求极高且会增加成本。

文章中公开了一种简单、高效、低成本的通过在IVT反应中添加解离剂来去除dsRNA的方法，将解离剂浓度控制在一定范围内，即可有效去除IVT产物中dsRNA，又不影响mRNA产量和质量。

dsRNA形成机制

*IVT反应体系中加入离散剂能有效减少dsRNA形成

作者选用了5000nt长度的mRNA作为样本，测试了包括尿素、甲酰胺等在内的离散剂不同浓度条件下对mRNA产物中dsRNA含量的影响。结果显示，较高浓度的尿素和甲酰胺能够有效减少dsRNA形成，且对mRNA产量影响不大，即不会影响T7 RNA聚合酶的效率。如上图所示，随着尿素和甲酰胺浓度升高，dsRNA含量减少明显，在较高浓度时（如0.8M尿素或1.6M的甲酰胺）时，dsRNA含量接近HPLC纯化后的结果。

*IVT反应中使用修饰碱基不影响离散剂减少dsRNA生产的效果

如果在 IVT过程使用修饰碱基如N-1-甲基-假尿嘧啶，尿素同样能够减少dsRNA副产物的生成 。

*IVT反应过程中越早添加离散剂效果越好

作者分别于五个时间点将8M尿素添加到五组IVT反应体系中，终浓度均为1M。从下图能看到，越早添加尿素IVT副产物dsRNA含量越小，这一结果说明尿素无法破坏已形成的双链RNA，仅能阻止双链RNA形成过程中碱基配对从而减少dsRNA的形成。

*添加离散剂减少dsRNA生成可降低mRNA产物免疫原性，提高翻译效率

上图中： mRNA1（IVT反应体系未添尿素）、mRNA2（IVT反应体系添加1.2M的尿素）和HPLC（IVT后HPLC纯化去除dsRNA方式），分别转染HepG2细胞系，利用in-cell Western Blot检测三组样本中蛋白表达量。从图5中可以看到，蛋白表达量最好的是mRNA2样本，mRNA1次之，比mRNA2少了20%，翻译效率最差的是HPLC纯化后的mRNA样本，这可能是因为HPLC过程中过高的温度或其他条件造成mRNA部分降解（图5A，第三泳道）。

添加离散剂后得到的mRNA产物中dsRNA含量低，避免了复杂的后续纯化过程，从而避免了mRNA的降解，能够更好地保持mRNA的完整性。从而提高翻译效率。

* 结 语

一种简单、有效、经济、可放大生产的方法可以有效调控和减少双链RNA杂质的产生，同时不影响mRNA完整性和产率，是理想的mRNA药物生产方法，希望研究者们尝试并推广使用。

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