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前言

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常称为大肠杆菌，其在Escherich于1885年发现后，因其具备能够方便的易于培养和传代且生长速率快，营养需求简单等优势，并具备完整的基因组序列信息和清晰的遗传学背景，目前被广泛运用于基因工程领域，其中胰岛素规模化生产是大肠杆菌作为合成生物学运用的第一个市场化产品。

华体会体育最新地址，作为细胞的“食物”，是细胞培养和发酵的基础，大肠杆菌伴随华体会体育最新地址 成分的变化也会产生不同的性状。可以根据其表现出的不同性状，将部分菌种进行特异性识别，同时也可以通过为目标菌种选择合适的华体会体育最新地址 来实现低成本、高表达以及稳定结构的表达，对某种特定产物进行特异性培养。
为了让同学们更好的了解大肠杆菌的培养相关知识，接下来菌菌就和大家一起从大肠杆菌的分离与培养两个方面对大肠杆菌和其华体会体育最新地址 之间的奥妙进行深入探讨。

大肠杆菌分离华体会体育最新地址

在实验室环境下，制备大肠杆菌华体会体育最新地址 主要是为了保证菌种的生长和繁殖。但在试验需要的情况下也要兼顾筛选菌种以及对菌种进行分离培养，接下来菌菌就以LB琼脂、伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂等为例，从分离华体会体育最新地址 的角度出发进行介绍。

1. LB琼脂Luria broth(LB)

营养液混合琼脂通常简称LB琼脂，是一种富含营养（酵母提取物、胰化蛋白胨和NACl）的非选择性固体华体会体育最新地址 ，通常用于培养实验室中的细菌。在LB中加入琼脂会形成一种凝胶，可以使细菌在其表面生长，因为细菌不能消化琼脂，却可以吸收LB营养液中的营养。在这种凝胶中加入一种抗生素（如青霉素、四环素、卡那霉素等），可以选择选择性培养对其耐药的细菌并去除杂菌，选择性培养的菌体的抗性是由携带抗生素抗药性基因的质粒赋予的。例如在大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备过程中，就会将含有氨苄青霉素的LB华体会体育最新地址 作为筛选所需质粒的大肠杆菌的华体会体育最新地址 。

2. 伊红美蓝琼脂（EMB）

伊红美蓝华体会体育最新地址通常简称EMB medium，为弱选择性华体会体育最新地址 ，主要用于大肠杆菌和产气肠杆菌的分离和鉴别，也适用于大肠菌群的分离培养。
其配方中各主要成分的作用为：蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖是大肠菌群发酵的糖类；磷酸氢二钾是缓冲剂；琼脂是华体会体育最新地址 凝固剂；伊红（Eosin Y）也称曙红或四溴荧光素，为酸性染料：美兰（eosin-methylene blue），也叫亚甲蓝（C16H18N3S·Cl），为碱性染料，二者在华体会体育最新地址 中均为指示剂。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电，所以染上红色，再与美兰结合而形成紫黑色菌落，并带有金属光泽；产气肠杆菌则呈棕色，很少有金属光泽，同时不分解乳糖的细菌，如沙门氏菌和志贺氏菌，则为无色或琥珀色半透明菌落；凝固酶阳性葡萄球菌为无色针尖大小的菌落；白色念珠菌则为蛛丝状或羽毛状菌落。

3. 麦康凯琼脂（MacConkey Agar ）

麦康凯琼脂常见缩写MAC琼脂，检验分离肠道菌最常用的华体会体育最新地址 ，在药典中用于大肠杆菌的检测，在食品标准用于肠道致病菌的分离。
华体会体育最新地址 中较多的胆盐及结晶紫对大多数革兰氏阳性菌有很强的抑制效果，大肠杆菌由于强烈发酵乳糖产酸，在华体会体育最新地址 上菌落为桃红色，并且菌落周围通常有明显的沉淀环，大肠菌群同样能发酵乳糖产酸，菌落也为桃红色，
致病性的肠道菌则通常因不发酵乳糖（如志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌等），菌落则呈无色。此华体会体育最新地址 由于对大肠杆菌的专一性较弱（大肠菌群和大肠杆菌的菌落特征比较接近），若样品中大肠菌群的含量比较高，分离大肠杆菌的效果并不理想。

4. 大肠杆菌显色华体会体育最新地址 /TBX华体会体育最新地址 （TBX medium）

利用酶底物法原理，对于大肠杆菌的分离和计数有高度的特异性，大肠杆菌特有的β-葡萄糖醛酸苷酶可分解华体会体育最新地址 中的底物，使菌落呈蓝绿色，而大肠菌群和其他大多数杂菌通常为无色或其他颜色，革兰氏阳性菌大多数不生长。特别是在干扰菌较多的情况下，显色华体会体育最新地址 的分离率要远高于其他的华体会体育最新地址 。缺点是价格较高，还有极少数大肠杆菌不产生β-葡萄糖醛酸苷酶，不能显色（如肠出血性大肠埃希氏菌O157菌）。此华体会体育最新地址 适用范围较广，食品、水、环境等均可检测。

5. 哥伦比亚MUG华体会体育最新地址 /MUG营养琼脂(MUG Nutrition Agar (NA-MUG)

原理与显色华体会体育最新地址 相同，大肠杆菌可利用β-葡萄糖醛酸苷酶特异性分解MUG，在紫外灯下产生荧光，特异性较强，极少数不产生β-葡萄糖醛酸苷酶的大肠杆菌不产荧光。但此华体会体育最新地址 没有选择性，多数杂菌都能生长，因此通常只用于含菌量较少的水中大肠杆菌计数。

6. VRBA-MUG华体会体育最新地址

在VRBA基础上添加了MUG，相比较于哥伦比亚MUG华体会体育最新地址 ，VRBA-MUG华体会体育最新地址 具有选择性，可抑制革兰氏阳性菌的生长，大肠杆菌和大肠菌群可在此华体会体育最新地址 中生长呈紫红色菌落，周围有沉淀环，由于添加了MUG，在紫外灯下照射时，大肠杆菌菌落可有荧光反应，而大肠菌群则没有荧光。此华体会体育最新地址 一般用于食品中大肠杆菌的检验和计数。

大肠杆菌发酵华体会体育最新地址

发酵华体会体育最新地址 是指为了在生产中更加适应菌种后续产物生成以及代谢废物的产生而设计的华体会体育最新地址 。例如，前面提到过的LB华体会体育最新地址 除了是添加抗生素以筛选带有所需质粒的分离华体会体育最新地址 外，其本身也是一种较为常用的发酵华体会体育最新地址 ，在此便不再赘述。其他常用的华体会体育最新地址 有SOB（Super Optimal Broth）华体会体育最新地址 、SOC（Super Optimal broth with Catabolite repression）华体会体育最新地址 、TB（Terrific Broth）华体会体育最新地址等。

1. SOB（Super Optimal Broth）华体会体育最新地址

SOB华体会体育最新地址 是另一种富营养华体会体育最新地址 。与LB华体会体育最新地址 相比，SOB华体会体育最新地址 中含有两倍多蛋白胨，蛋白胨中富含氨基酸及多肽。另外，SOB华体会体育最新地址 中含有镁离子，镁离子是高密度培养必须的离子。利用SOB华体会体育最新地址 培养大肠杆菌在普通条件（250rpm）下摇瓶培养，菌浓可达到OD600 3-5左右，如果提高转速到350rpm，OD600最高能够达到10-15。在SOB华体会体育最新地址 中的大肠杆菌具有更高的转化效率，因此常用SOB华体会体育最新地址 制备感受态细胞。

SOB华体会体育最新地址 的配方如下：2% 胰蛋白胨,0.5% 酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl,10mM MgCl2,10mM MgSO4

2. SOC（Super Optimal broth with Catabolite repression）华体会体育最新地址

SOC华体会体育最新地址 跟SOB华体会体育最新地址 的唯一区别是SOC中包含有20mM葡萄糖（glucose）。华体会体育最新地址 中的葡萄糖充当分解代谢抑制物（catabolite repressor）。大肠杆菌更倾向应用葡萄糖作为碳源。因此在葡萄糖存在的情况下，其他的碳源的分解就会被抑制。在20mM 葡萄糖存在下，乳糖不会被代谢，乳糖操纵子被抑制，外源基因不会发生表达，这就减少了外源基因表达给细胞带来的生长压力。因此，利用SOC华体会体育最新地址 进行转化反应时，热激后细胞生长的速率会比LB华体会体育最新地址 中高出很多。当实验室中没有储存SOC华体会体育最新地址 时，在LB中加入20mM葡萄糖，效果是一样的。

SOC华体会体育最新地址 配方如下：2% 胰蛋白胨,0.5% 酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl,10mM MgCl2,10mM MgSO4，20mM葡萄糖

3. 2x YT （Yeast extract and Tryptone）华体会体育最新地址

2x YT华体会体育最新地址 是比LB华体会体育最新地址 营养更为丰富的华体会体育最新地址 。与LB华体会体育最新地址 成分相比，2x YT华体会体育最新地址 中包含有更多的的酵母提取物和胰蛋白胨。因为华体会体育最新地址 中营养更丰富了，细胞能够生长更长的时间，浓度达到更高的值。2x YT华体会体育最新地址 主要用来进行大肠杆菌以及像是M13这样的细菌噬菌体的培养。由于大肠杆菌的浓度很高，在生产大量的噬菌体的同时，宿主仍然是存活的。

2x YT华体会体育最新地址 的配方如下：1.6% 胰蛋白胨,1% 酵母提取物,0.5% NaCl

4. TB（Terrific Broth）华体会体育最新地址

TB 华体会体育最新地址 是添加了磷酸盐的复合型华体会体育最新地址 。跟LB华体会体育最新地址 相比，TB华体会体育最新地址 中除了多出20%的胰蛋白胨和380 %的酵母提取物以外，还多了 0.4%的甘油作为额外的碳源。所有这些元素能够支持大肠杆菌在正常的摇瓶培养条件下生长到 OD600 5–8。TB华体会体育最新地址 通常用于蛋白质表达和质粒提取。

TB华体会体育最新地址 配方如下：2 % 胰蛋白胨,2.4%酵母提取物,72mM K2HPO4,17mM KH2PO4,0.4% glycerol

5. SB （Super Broth）华体会体育最新地址

与LB华体会体育最新地址 相比，SB华体会体育最新地址 成分中多出了220%的胰蛋白胨和380%的酵母提取物。因此SB华体会体育最新地址 富含超多量的胰蛋白胨和酵母提取物。据估计蛋白胨和酵母提取物中包含的主要营养元素远远超过细胞生长达到饱和时所需的量。SB华体会体育最新地址 主要用于质粒以及蛋白质的提取。

SB华体会体育最新地址 配方如下：3.2% 胰蛋白胨,2% 酵母提取物,0.5% NaCl

6. M9培养

最低盐(M9)华体会体育最新地址 含有必需盐和氮，传统上由葡萄糖、氨基酸和维生素作为补充物。M9华体会体育最新地址 适用于大肠杆菌菌株的非选择性培养，用于克隆、生产DNA、质粒DNA和重组蛋白。如果添加适当的抗生素，它也适用于选择性培养带有抗生素抗性的菌株。普遍认为LB中培养的细菌应该比M9中生长更快，异源基因的表达水平也会更高。

7. GYT华体会体育最新地址 （ GYT medium ）

GYT华体会体育最新地址 是由Tung等人发明的一种华体会体育最新地址 ，可以用于各种细菌培养,是分子生物学常规试剂。主要由胰蛋白陈、酵母提取物、甘油等组成，经无菌处理。

8. MBL华体会体育最新地址

MBL华体会体育最新地址 是以葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、KHPO4、(NH4)2HPO4、MgSO4为主要成分的发酵华体会体育最新地址 。

总结

为了支持更好的进行细胞筛选以及发酵表达，对于培养的选择和成分的控制是至关重要的。只有通过不断优化组成成分，物理化学特性，获得能进行大规模表达抗体的稳定的华体会体育最新地址 。更好的理解华体会体育最新地址 才能促使华体会体育最新地址 的发展，使不同的细胞系获得高表达和产品质量。细胞华体会体育最新地址 已经从早期含有血清的华体会体育最新地址 发展到了复杂的含有水解物的华体会体育最新地址 ，完全化学成分限定的无蛋白的华体会体育最新地址 配方。通过平衡基础华体会体育最新地址 和补料华体会体育最新地址 的组成，优化细胞吸收到的营养成分，控制最终的渗透压，通过化学计量方式的补料方式，共同优化细胞培养工艺和华体会体育最新地址 组成，以最大限度的提高表达和一致性，这是一条需要不断钻研的道路。

参考文献：

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【2】An indigoidine biosynthetic gene cluster from Streptomyces chromofuscus ATCC 49982 contains an unusual IndB homologue [J] . Dayu Yu,Fuchao Xu,Jonathan Valiente,Siyuan Wang,Jixun Zhan. Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology . 2013 (1)

【3】A novel reporter system for bacterial and mammalian cells based on the non-ribosomal peptide indigoidine [J] . Metabolic Engineering . 2012 (4)

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