前言

癌症疫苗通过在体内表达抗原来诱导抗肿瘤反应。在所有的癌症疫苗中，RNA癌症疫苗被认为是最有前途的疫苗，它能够在细胞质中快速表达抗原以激活强大的免疫反应，避免基因组整合或T细胞耐受的风险。然而RNA分子本质上是不稳定的，容易被广泛存在的RNase酶降解。环状RNA（circRNA）是一类单链闭合的环状RNA分子，由mRNA前体（pre-mRNA）通过可变剪接，外显子环化或内含子环化产生，不包含5'端帽结构和3'端poly A，缺乏游离末端，因此不易被核酸外切酶降解，比线性mRNA更稳定。近年来，天然circRNA的大量生物学功能被揭示，从蛋白质和基因海绵、细胞活动调节剂到蛋白质翻译模板。到目前为止，合成的circRNA不仅被用于治疗，例如替代治疗性蛋白质和多肽以及疫苗，也用作生物传感器。
目前北大魏文胜团队体外制备的circRNA疫苗，可有效对抗新冠病毒，详见环状RNA（circRNA），抗击新冠病毒的新平台。基于circRNA的癌症疫苗尚未开发出来，值得尝试评估circRNA疫苗在肿瘤免疫治疗中的适用性，以优化疫苗的稳定性。2022年8月，清华大学医学院林欣团队在《Theranostics》发表文章：Circular RNA cancer vaccines drive immunity in hard-to-treat malignancies，她们建立了一种新型circRNA疫苗平台，能够激活强大的先天性和适应性免疫，并在多种小鼠肿瘤模型中显示出优异的抗肿瘤效果。下面菌菌带大家认识这个新型circRNA癌症疫苗平台，以及抗肿瘤实验结果。
 

体外合成可翻译的circRNA

研究者利用置换的内含子-外显子元件（permuted intron-exon，PIE）通过体外反向剪接合成circRNA[1]，并使用独立的翻译起始结构（independent translation initiation structure，IRES）起始翻译（图1A）。研究者采用半衰期约为2小时的不稳定D2GFP蛋白作为模型来鉴定circRNA在体外的稳定性和持久性。为了验证剪接合成circRNA D2GFP的准确性，研究者对合成的circRNA D2GFP进行逆转录，并使用跨接引物来扩增产物，最后通过Sanger测序确定circRNAD2GFP正确合成。然后，研究者利用人源HEK293T细胞和鼠源NIH3T3细胞进行体外实验，观察到与未修饰的mRNAD2GFP和M1Ψ mRNAD2GFP组相比，circRNAD2GFP组中的D2GFP更持久（图1B-C）。统计结果还表明，circRNA D2GFP组中D2GFP阳性细胞的比例在转染后48小时和72小时均显著高于其他组（图1D-E）。

图1 circRNA和线性mRNA的蛋白质表达
 

制备circRNA-LNP复合物

接着，研究者开发了一个LNP系统来研究circRNA疫苗在体内的功能。将OVA （257-264）-荧光素酶编码的circRNA（circRNA OVA-luc）纯化并用LNP封装形成稳定的复合物（图2A），适用于体内转染。随后对该复合物进行形态学鉴定，并且证实该复合物在不影响细胞状态的情况下均能在体内/体外进入细胞翻译相应蛋白（图2B-F）。由于不同的IRES元件甚至相同的IRES元件也可能在不同的细胞种具有不同的翻译启动效果，研究者将具有四种不同IRES元件的OVA-luc（CVB3-IRES、EV29-IRES、EV33-IRES和VICP-IRES）与LNP包装在一起，对其翻译效率进行检测和比较。体内外实验结果表明，EV29和CVB3都是小鼠肌肉组织中circRNA OVA-luc疫苗接种的理想元件（图2G-H），研究者最终选择CVB进行研究。

图2 circRNA-LNP复合物的体外和体内表征
 

CircRNA-LNP疫苗可诱导强效免疫

由于先天性和适应性免疫反应对于抗肿瘤免疫都是必不可少的，研究者紧接着研究了由circRNAOVA-luc -LNP复合物对机体先天/适应性免疫反应的激活能力（图3A）。研究者首先对小鼠进行肌肉注射circRNA OVA-luc -LNP 疫苗，提取外周血进行Elisa检测，然后收集小鼠外周血并检测血清中的IL-6和TNF-α（图3B-C）。结果显示，注射circRNA OVA-luc-LNP均能增加IL-6和TNF-α的产生，表明其能产生先天免疫反应。为了检测抗原特异性T细胞反应，取小鼠脾脏进行Elispot测定（图3D-E）。结果显示三种circRNA OVA-luc -LNP 疫苗均诱导了强烈的抗原特异性T细胞反应。这些疫苗的全身毒性通过主要器官的苏木精和伊红染色评估这些疫苗的全身毒性，未观察到明显的毒副作用（图3F）。

图3 circRNA-LNP疫苗诱导先天性和适应性免疫反应
 

CircRNA-LNP疫苗介导有效的抗肿瘤应答

基于之前的实验结果，研究者通过MC38-OVA细胞建立免疫排斥小鼠肿瘤模型来评估RNA-LNP疫苗的抗肿瘤效果。实验方案如图4A，结果显示两剂疫苗circRNA OVA-luc-LNP和M1Ψ mRNA OVA-luc -LNP 接种后均能显著抑制肿瘤生长（图4B）。第一次疫苗接种后，通过流式细胞术检测小鼠适应性免疫反应，结果表明RNA-LNP疫苗触发了强大的抗原特异性T细胞应答（图4C-D）。第二次注射疫苗接种后，两个RNA-LNP组的IFN-γ分泌均显著增加，而circRNA OVA-luc -LNP组的TNF-α分泌略强于M1Ψ mRNA OVA-luc -LNP 组。

图4 circRNA-LNP疫苗在MC38皮下肿瘤模型中抑制肿瘤生长并驱动有效的抗原特异性T细胞反应
 

CircRNA-LNP疫苗在免疫沙漠原位转移黑色素瘤模型中抑制肿瘤进展

为了验证circRNA-LNP疫苗出色的抗肿瘤性能，研究者进一步建立了非免疫原性转移和原位肿瘤模型。对于原位接种的治疗模型，circRNAOVA-luc -LNP和M1Ψ mRNA OVA-luc -LNP的疫苗接种完全抑制了肿瘤的生长（图5B）。所有小鼠在肿瘤接种后25天内死亡，而所有小鼠在接种RNA-LNP的组中均存活（图5C）。肿瘤生长曲线图显示对照组的肿瘤体积显著增加，而接种组的肿瘤减少到无法检测到的水平（图5 D-F）。为了研究RNA-LNP疫苗是否可以阻止肺转移，研究者用两种RNA-LNP疫苗对小鼠进行免疫，然后通过尾静脉注射B16-OVA细胞（图5G）。在注射肿瘤细胞前一天，在外周血中测定了抗原特异性T细胞。结果显示SIINFE-L-MHC-I四聚体阳性细胞毒性T细胞的百分比显著增加（图5H），这表明疫苗接种已经提供了免疫保护。与之前结果一致，所有接种疫苗的小鼠在肿瘤细胞注射后都存活了两个月（图5I）。这些结果表明，由circRNA OVA-luc -LNP和M1Ψ mRNA OVA-luc -LNP触发的免疫反应和抗肿瘤功效无显著差异，表明circRNA疫苗是改良型mRNA癌症疫苗的理想替代品。

图5 circRNA-LNP疫苗抑制B16原位转移瘤模型的进展
 

CircRNA-LNP疫苗通过与过继细胞移植治疗协同作用诱导晚期肿瘤模型的肿瘤完全消退

由于患者在诊断时通常表现出高肿瘤负荷，因此联合治疗对于消除晚期肿瘤更为理想。过继细胞移植治疗（adoptive cell transfer therapy，ACT）是一种有潜力的免疫疗法，但是在进行治疗时移植的T细胞增殖能力相对不足[2, 3]。所以研究者认为癌症疫苗能够体内刺激T细胞，从而产生协同抗肿瘤作用。研究者通过B16-OVA细胞建立了晚期“免疫沙漠原位模型”（图6A）。结果显示circRNA疫苗接种和联合治疗均引发了强烈的抗肿瘤反应，而单独的TCR-T治疗与对照组相比仅提供了轻微的抗肿瘤功效（图6B）。还分析了小鼠存活率（图6C），PBS组和OT-I组29天内小鼠全部死亡。接种组的五只小鼠中有三只，而联合组的所有小鼠都存活了60天以上。各组肿瘤生长曲线（图6D）显示，联合组中所有的肿瘤都完全消失了，这表明circRNA疫苗和TCR-T联合治疗优于单药治疗。为了揭示联合治疗协同作用的潜在机制，研究者将OT-I T细胞转移到 CD45.1+ C57BL/6J上，并用circRNA OVA-luc -LNP对其进行免疫（图6H），发现联合组中OT-I T细胞的百分比显著高于OT-I 组（图6I-J），从而证明circRNA-LNP确实提高了TCR-T细胞的持久性。

图6 circRNA-LNP疫苗在B16晚期模型中与OT-I T细胞移植具有协同作用
 

​综上，研究者通过将编码抗原的circRNA封装在LNP中，建立了一种新的circRNA疫苗平台。与体外的线性mRNA相比，circRNA表现出更高的稳定性和更持久的蛋白质表达。CircRNA-LNP能够激活机体强大的先天免疫反应和有效的抗原特异性T细胞反应，并在各种小鼠肿瘤模型中表现出非凡的抗肿瘤性能。最后研究者提供了一种RNA-LNP疫苗联合ACT的治疗方法，为今后在许多难以治疗的恶性肿瘤中开发circRNA疫苗提供了新思路。由于其高稳定性、简单和经济的制造过程，circRNA-LNP平台有望成为一种有吸引力的疫苗替代品，在临床转化方面表现出巨大的潜力。CircRNA是RNA家族中又一颗冉冉升起的新星。2021年2月，circRNA领先企业Orna Therapeutics获8000万美元A轮融资，用于开发工程化circRNA药物；Laronde分别于2021年5月10日与2021年8月30日完成5000万美元的A轮融资以及4.4亿美元的B轮融资；在国内，上海环码生物在2021年6月宣布完成千万美元级别的天使轮融资，旨在开发基于circRNA的创新疗法。2022年6月21日，北京圆因生物宣布完成超过2.8亿元人民币A轮融资利用circRNA技术开发新型疫苗及新型治疗领域。2022年8月，默沙东投入超36亿美元布局circRNA，也再次显示了circRNA的广阔潜力。CircRNA疗法已成为RNA领域新的吸金点，这标志着circRNA疗法已从幕后真正走向了前台。
 

参考文献：

[1] WESSELHOEFT R A, KOWALSKI P S, ANDERSON D G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells [J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2629.

[2] MAJZNER R G, MACKALL C L. Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey [J]. 2019, 25(9): 1341-55.

[3] ANANDAPPA A J, WU C J, OTT P A. Directing Traffic: How to Effectively Drive T Cells into Tumors [J]. Cancer discovery, 2020, 10(2): 185-97.

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