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前言

mRNA疗法成为一种拥有无限前景，可能颠覆现代医学技术的基因治疗平台。与重组蛋白相比，mRNA疗法通过体外转录合成，更加快速灵活，低成本。但是mRNA 疗法面临的技术壁垒也是非常明显的，例如，mRNA固有的化学不稳定性，翻译效率的限制，自身的免疫原性极大地减弱mRNA疫苗的保护效率。因此，重新设计优化mRNA序列，避免制备、运输、注入机体环境过程所造成的损耗，可以极大提升mRNA稳定性和翻译效率。

今天菌菌给大家详细阐述mRNA五个组成元件的优化策略，旨在提高mRNA的稳定性和翻译效率。关于mRNA的序列设计之前菌菌有过相关介绍，详见【星耀小课堂】mRNA篇|mRNA序列设计全解析。

图1 mRNA的结构组成及优化策略[1]

一、mRNA序列优化：5' Cap

5′ Cap结构可保护mRNA不被胞质外切酶Xrn1和核内Xrn2酶降解，与3'端的poly A尾、poly A结合蛋白（PAPB）和翻译起始因子蛋白协同作用，起始蛋白质的翻译。因此，加帽的mRNA比没有加帽的mRNA具有更长的半衰期和更高的稳定性，加帽明显提高了细胞内蛋白质合成的产量。根据甲基化修饰的程度不同分为3种帽结构：Cap 0、Cap 1和Cap 2。Cap 1和Cap 2是mRNA最常见的帽子修饰，可以提供一个区分自我和非自我mRNA的分子标记。未加帽mRNA或Cap 0结构的mRNA会被天然免疫受体RIG-1识别，而Cap 1和Cap 2则可保护其自身不被先天免疫感应器识别。不过，这些不同的帽修饰是如何避免了免疫刺激，这依旧是mRNA技术领域需要关心的问题。

图2 共转录加帽和酶法加帽的加帽原理。SAM，S-腺苷甲硫氨酸[1]

对于体外转录（In Vitro Transcription，IVT）合成的mRNA，常见的有两种加帽方法（图2）：共转录加帽和酶法加帽，具体的加帽原理与步骤【详见mRNA体外制备之酶法加帽和共转录加帽】。但是应当注意共转录加帽会出现反向加帽的结果，从而导致快速的降解和较低的翻译效率。为了避免反向加帽，抗反向帽子结构类似物（anti-reverse cap analogs，ARCA）被开发和使用，从而确保加帽的正确性。 ARCA是一种经过修饰的帽类似物，其中 3′ OH 基团（接近 m7G）被 –OCH3 替换。由于该取代，RNA 聚合酶只能使用剩余的羟基团启动转录，迫使 ARCA 以正向掺入。过去的几年时间，新开发的Clean Cap类似物有望在高效率的共转录加帽过程中实现 Cap 1 或 Cap 2的结合。所以，稳定的、正确方向的帽子结构应当被考虑到高效的mRNA疫苗中。相比于共转录加帽，酶法加帽具有更高的加帽率，但是各类酶成本较高，工艺流程繁琐。研究者可以根据各自的需求选择不同的加帽方案，实现高质量、高表达效率的mRNA产品。

二、mRNA序列优化：5' UTR

真核mRNA翻译起始调控主要由5′ UTR特征决定，包括二级结构、序列元件和5′ UTR长度（图1）。耀海生物具有多元化的UTR来源选择和成熟的UTR改造策略，并建立了天然的UTR库。对5′ UTR的优化策略主要有：

• 1. 直接选取在人体细胞内表达效率极高的基因的5' UTR，例如最为常用的β-球蛋白的UTRs；

• 2. 通常包含强起始密码子Kozak 序列gccRccAUGG，在这里起始密码子被高度保守的核苷酸包围。因为常见的mRNA翻译起始密码子AUG并非都能启动翻译；

• 3. 在真核生物中，哺乳动物的5′ UTR平均长度为100 - 200 nt左右，酵母的为50 nt左右。虽然超短的5′ UTR能够进行翻译起始，但一般认为核糖体有效识别起始密码子需要的5′ UTR最小长度为20 nt。为缩短扫描过程，常推荐使用较短的5′ UTR （≥20 nt）。

• 4. 在5′ UTR的上游序列设计时，应尽量控制可能的起始密码子（尤其是AUG）的存在，进而控制出现uORF的可能。uORF是起始密码子位于5' UTR中的开放阅读框，其翻译后会诱发mRNA衰变，通过阻断43S核糖体的扫描或隔离80S核糖体，阻碍核糖体向下游CDS移动。

• 5.避免5′ UTR，尤其是近5′端形成高度稳定的二级结构是极为重要的，因为二级结构会破坏核糖体加载、扫描及起始密码子的选择。

三、mRNA序列优化：CDS

CDS区作为mRNA的蛋白编码区，对mRNA的翻译和稳定性是至关重要的。对CDS的优化主要集中在密码子优化。目前已经讨论了三种密码子优化策略以增强mRNA的翻译和稳定性[2]。

第一种策略是对每个氨基酸使用更频繁的密码子，或者也使用具有更高tRNA丰度的密码子[3]。

另一种策略是优化双密码子的使用；换句话说，使用最佳的最佳密码子对[4]。

第三种策略是修改CDS序列，以便在目标物种和细胞的高表达蛋白质中天然发现的每个密码子具有相同的比例。

耀海生物拥有前沿的CDS优化团队，与专业AI算法团队合作，完成多个项目CDS区的密码子优化。关于此方面的问题，大家可以文末查看菌菌的联系方式。

但是，我们需要知道，密码子并不是影响蛋白表达的唯一因素，还存在其他因素，例如稀有密码子，GC含量，二级结构（自由能）等。稀有密码子会导致核糖体花费很多时间才能找到匹配的低丰度的tRNA，从而导致核糖体在mRNA上的停滞不前，甚至引起mRNA降解。在序列优化过程中避免出现稀有密码子的存在。但当把外源mRNA序列中的密码子全部更换为宿主细胞的最佳密码子，可能反而导致蛋白无法表达，因为由一些蛋白（例如复杂的抗原）的表达需要稀有密码子的存在，延缓核糖体前进的速度，为蛋白质的正确折叠来提供足够的时间。因此可以根据不同的抗原，使用不同的密码子策略。研究表明，增加GC含量可以提高mRNA的稳定性和翻译效率，所以优化CDS中的GC含量是治疗性mRNA设计中广泛应用的策略。二级结构成为序列优化的另一个重要方向。研究发现，mRNA在体内会形成不同的二级结构，二级结构越稳定，mRNA在体内的半衰期越长，其表达出的蛋白量就越多。

四、mRNA序列优化：3' UTR

与5′ UTR相似，3′ UTR也包含了许多调控元件，对mRNA的稳定性、亚细胞定位和翻译效率有重要作用。目前，3′ UTR的优化方法主要有：

• 1. 通常选用来源于β-球蛋白mRNAs的3′ UTR作为治疗性mRNA的3′ UTR；

• 2. 一般认为，较短的3′ UTR更有利于转录本的稳定，这可能是由于缺少微小RNA（microRNA，miRNA）结合位点，从而避免了mRNA的降解；

• 3. 避免出现富含腺苷酸/尿苷酸元件（AU-rich element，ARE）等顺式调节元件，当它与一些AU结合蛋白（AU-binding proteins，AUBPs）相互作用会引起ARE介导的mRNA衰变；

• 4. 避免出现反式作用因子miRNA，它通过翻译抑制和/或mRNA降解来调节60%以上的人类蛋白编码基因的表达；

• 5.高通量筛选，比如大规模平行试验和细胞库筛选等。

五、mRNA序列优化：poly A尾

图3 一步法加尾和酶法加尾[1]

Poly A尾保护帽结构不被降解，与poly A结合蛋白、5′ Cap和翻译起始因子蛋白协同作用，启动蛋白质的翻译。目前主要开发了两种方法将poly A尾巴添加到IVT合成的mRNA中（图3）。

第一种方法是酶法加尾，利用poly A聚合酶将poly A序列添加到mRNA的3′ 端，它是在体外转录后加上去的，会出现尾长不一，重复性差等问题；

第二种方法是一步法加尾，依赖RNA聚合酶从DNA模板中转录poly A序列，使用DNA模板在体外转录时得到的，poly A尾长度确定，因而这种一步操作在临床和制造业中应用广泛。耀海生物设计的poly A尾分布均一，poly A尾一体化转录形成，分布更为均一。

Poly A尾的优化策略主要有以下几点：

• 1.Poly A尾的长度显著影响其与PABP的结合能力，poly A尾的最佳长度大致在120-150 nt。32 nt以上的poly A尾在翻译效率上等同于150 nt长度的poly A尾，但是外源性递送mRNA的高效翻译至少需要16 nt长度的poly A尾；

• 2. 为了抑制poly A介导的mRNA衰变，可以设计包含不连续的非A残基（如鸟嘌呤）的poly A尾；

• 3. 为了避免ploy A尾巴缩短，把poly A序列间隔开来，中间用Spacer序列连接，可以维持尾巴长度，同时不影响体外转录生成的mRNA的翻译效率和半衰期[5]。

结语

mRNA序列优化是mRNA平台的核心技术。今天菌菌给大家解析了各个组成元件的优化策略，希望大家对mRNA序列优化有初步的了解。mRNA的序列优化可比为梁山英雄们排序难得多，这个工作可不是用算盘能够解决的。业内人士预判，在精准医学背景下，AI技术与高通量验证法虚实结合，将是mRNA序列优化的新路径，也是最新的发展目标。希望通过对序列优化和修饰，配合恰当的递送系统后能够降低药物剂量、给药频率和不良反应发生率。

详情请咨询耀菌君：13380332910（微信同号）。

参考文献：

[1] JIA L, QIAN S B. Therapeutic mRNA Engineering from Head to Tail [J]. 2021, 54(23): 4272-82.

[2] MAURO V P. Codon Optimization in the Production of Recombinant Biotherapeutics: Potential Risks and Considerations [J]. BioDrugs : clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy, 2018, 32(1): 69-81.

[3] FUGLSANG A. Codon optimizer: a freeware tool for codon optimization [J]. Protein expression and purification, 2003, 31(2): 247-9.

[4] ALEXAKI A, KAMES J, HOLCOMB D D, et al. Codon and Codon-Pair Usage Tables (CoCoPUTs): Facilitating Genetic Variation Analyses and Recombinant Gene Design [J]. Journal of molecular biology, 2019, 431(13): 2434-41.

[5] TREPOTEC Z, GEIGER J, PLANK C, et al. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life [J]. RNA (New York, NY), 2019, 25(4): 507-18.

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