支原体的污染来源：

（1）细胞之间交叉污染；

（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；

（3）工作环境或实验器材的污染；

（4）华体会体育最新地址 的污染。

支原体污染的严重性：

（1）细胞外形可以没有明显的变化，支原体可以与细胞共存，污染后细胞不会死亡，华体会体育最新地址 一般不发生浑浊；

（2）使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验结果，因为支原体会抑制细胞生长、导致染色体畸变、细胞膜抗原性改变、细胞复苏后存活率降低等。

（3）影响细胞的代谢和功能：培养液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；支原体活动使培养液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。

（4）培养过程中细胞破碎较多，华体会体育最新地址 pH变化明显，需要频繁更换新鲜华体会体育最新地址 ；

（5）细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。

支原体污染的检测及鉴定方法：

①分离培养法检测

支原体的病原学检测主要是从被污染的细胞、鸡胚中分离培养出支原体来确定，分离培养法是检测支原体污染中最为可靠准确的方法。但是支原体对环境的影响敏感，容易被灭活，而且分离培养操作相对繁琐，所需时间较长，因此只能够对支原体污染进行定性观察。分离培养法在常规的支原体检测中多用于辅助其它检测方法。

②DNA荧光染色法检测

DNA荧光染色法较分离培养法缩短了检测周期，主要用于细胞培养中污染支原体的检测。DNA荧光染色法正是利用荧光染色剂双苯咪唑（Bisbenzimidzole）Hoechst33258能够结合支原体DNA中的A-T碱基富集区域的原理，被支原体污染的细胞经染色后，其细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光点，即是富含A-T碱基区域的支原体DNA。

③PCR检测

PCR作为一种快速、灵敏、特异且简便的基因诊断技术已应用于科学研究和疾病的诊断。根据支原体基因组内的保守序列设计特异引物，对待检样品的核酸进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出诊断。PCR检测技术用于支原体污染的检测，周期短、灵敏度高、特异性好、操作简单且一次可检测大量样品。

④酶联免疫吸附试验（ELISA）检测

ELISA用于支原体污染的检测中，有着良好的特异性和敏感性，一次可以完成大量样品的检测。如今已有LONZA等公司开发了针对细胞中污染支原体的检测试剂盒，具有简便、快速与定量定性检测等特点。

⑤电镜检测

一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

细胞培养时支原体感染的预防：

支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。此外，在培养细胞时还需从以下几个方面进行控制以预防支原体污染：

1）控制环境污染

2）严格实验操作

3）细胞华体会体育最新地址 和器材要保证无菌

4）在细胞华体会体育最新地址 中加入适量的抗生素

当细胞被支原体污染后，必须对支原体进行清除，常用方法有：

①对于非重要的细胞，如培养中的细胞、WCB的细胞等，将培养物与用过的华体会体育最新地址 灭活后丢弃即可。对于较为重要的细胞，如来源珍贵或实验室中细胞保藏量较小等可以采用以下方法。

②用MRA处理：用支原体清除剂（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，作用浓度为 25μg/ml，两周可以清除支原体。

③用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

④药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

⑤使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

⑥动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

⑦巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

⑧使用支原体清除华体会体育最新地址 ，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1~2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。