.Protein G填料纯化抗体原理

Protein G是一种存在于C组和G组链球菌的细胞壁上胞壁蛋白，它具有和IgG进行特异性结合的能力，天然的Protein G含有3个区域可以结合IgG。Protein G比Protein A对IgG的亲和力更强,并且结合抗体的类型也相对较多，比如可以结合人IgG3、小鼠IgG1等。将Protein G蛋白偶联至填料上，即可从发酵液，动物腹水或血清中纯化IgG及其亚类。

★ Protein G也可以与IgG的Fc片段中重链CH2和CH3连接处的一段氨基酸序列产生特异性结合，此外还可以与Fab片段中CH1区域进行结合(亲和力相对较弱)

※对于不同物种的IgG，由于其氨基酸序列的不同，其对Protein G的结合能力也不同。对于同一物种，不同亚型的抗体对Protein G结合能力也会出现不同的情形

2.ProteinG填料介绍

Protein G填料主要是通过偶联试剂将填料基质进行活化，再将Protein G蛋白与活化基团进行反应并以共价键的形式与填料连成一个统一的整体。

偶联至填料上的Protein G蛋白相对稳定，在使用4mol/L尿素、硫氰酸胍、6mol/L的盐酸胍处理后，仍可保持活性。

天然的Protein G蛋白不耐碱，即使对其蛋白序列改造，仍不具备耐碱性能，因而不可以使用氢氧化钠溶液对其进行再生处理，对内毒素的控制也不如Protein A填料方便，正是因为该原因，限制了Protein G填料的应用。

对于Protein G填料采用的基质主要有琼脂糖基质，葡聚糖修饰的琼脂糖基质，纤维素基质，以及聚合物基质(如PS基质，硅胶基质)。基质的材质可以影响配基的偶联量，继而影响填料的载量；基质粒径及孔径的大小可以影响纯化过程使用的流速以及抗体与填料的结合速率

3.Protein G填料纯化抗体的流程

所需试剂：

平衡：1X PBS ，pH7.4

洗杂Buffer：1X PBS +适合浓度的盐，pH7.4

洗脱Buffer：0.1M甘氨酸或0.05M/0.1M柠檬酸或0.1M醋酸 (pH范围为2.0~3.5)

中和Buffer：1M Tris-HCl， pH8.5

实验步骤：

1.将Protein G填料装入层析柱中，使用≥ 5倍填料体积的平衡Buffer对填料进行平衡

2.将样品进行上样过柱(样品上样前需经过0.45um/0.22um的滤膜过滤处理)，上样流速参照选用Protein G填料说明书

3.使用5~10倍填料体积的洗杂Buffer清洗填料

4.使用3~5倍填料体积的洗脱Buffer对进行洗脱，收集洗脱液时可以分管进行收集

5.向收集的洗脱液中加入1/10倍体积的中和Buffer

6.填料再生：使用3倍体积平衡Buffer清洗填料，再使用2~3倍填料体积终浓度0.1%的非离子型去污剂(如TritonX-100) 流经填料15~30min以除去残留在填料上的疏水蛋白，脂蛋白，脂类等杂质，最后使用5倍填料体积除菌的平衡Buffer清洗填料

※填料的灭菌可以使用含2%二氯噻烷的20%乙醇溶液进行清洗6h以上

※填料的灭菌也可以使用70%乙醇溶液进行清洗12h以上

一般情况下，使用Protein G填料一步纯化也可获得95%以上的抗体纯度，这与Protein A填料类似

4.ProteinA/Protein G对各类型抗体亲和力比较

FAQ：

1.纯化出的抗体量少

①检查样品流经填料后的穿透液→如穿透液中有大量未结合的抗体，可以换用其他配基的填料如Protein A或Protein L填料；可以降低上样流速

②抗体在洗脱的过程中发生了沉淀→优化洗脱液，如适当提高洗脱液的pH；在低温下洗脱

③抗体与填料结合牢固，未能被洗脱→使用更低pH的洗脱液洗脱；增加洗脱液的盐浓度

2.纯化的抗体中含有大量杂蛋白

①使用的填料过多→根据填料的载量减少填料的使用量

②洗杂不充分→增加洗杂液的体积；适当提高洗杂液中的盐浓度；适当调低洗杂液的pH进行洗杂

③非特异性吸附→在洗杂液中加入终浓度为0.1%的Tween-20

④抗体发生降解→处理样品时加入蛋白酶抑制剂

⑤未知原因→洗脱时采用分管收集

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