本文主要讲述了酵母表达蛋白步骤，详细酵母表达流程。从感受态细胞制备，转化方法选择及操作，从化学试剂PEG1000转化，电击转化，原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛选及最终的蛋白表达，全套酵母蛋白表达标准操作流程。

质粒线性化

转化方法

毕赤酵母PEG1000转化及感受态制备

※配置缓冲液

①缓冲液A：1.0M 山梨醇，10mM甘氨酸，pH8.35,3%（v/v）乙二醇，滤膜过滤，-20℃保存；

②缓冲液B：40%（w/v）PEG1000，0.2M 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；

③缓冲液C：0.15M NaCl，10mM 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；

④未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存

※感受态制备

①接种酵母受体菌单菌落于YPD平板（YPD：蛋白表达试剂配置），30℃培养2天；

②挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体华体会体育最新地址 中，30℃摇床震荡过夜；

③过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mlYPD华体会体育最新地址 中震荡培养至OD值从0.1至0.5~0.8；

④3000~5000rpm离心收集沉淀菌体，用50ml预冷A液洗涤，并重悬与4mlA液中；

⑤根据每次使用量（0.1-0.2ml左右）分装与1.5ml离心管中，每管加入10ul的预冷DMSO，混合后迅速-80℃/液氮（感受态可以放到-80℃ ，但是酵母表达建议感受态现做现用）

※酵母转化

①线性化质粒50ug（可预冷）溶于200ul的TE中，直接加入冻存的酵母感受态中；

②37℃水浴5min，过程混合样品2次；

③取出加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；

④30℃水浴1小时；

⑤室温2000rpm离心10min，去上清，得沉淀，重悬菌体与1.5ml缓冲液C中；

⑥再次离心，去上清，得沉淀，轻轻加入0.2ml缓冲液C重悬；

⑦将重悬的转化液涂与选择性华体会体育最新地址 （根据抗性配置）中，30℃孵育3-4天，进行鉴定。

毕赤酵母电击感受态细胞制备及转化

※感受态制备

①接种酵母受体菌单菌落于YPD平板，30℃培养2天；

②挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体华体会体育最新地址 中，30℃摇床震荡过夜；

③过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mlYPD华体会体育最新地址 中震荡培养至OD值1.2~1.5；

④4℃，5000rpm离心5min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体；

⑤4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体；

⑥再次4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体；

⑦20ml，1mol/L山梨醇洗涤1次；

⑧将菌体溶于200ul，1mol/L预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化

※酵母电转

①准备好80ul的酵母感受态与线性化的质粒1-5ug（冰上预冷15min）混合，迅速放入0.2cm的电击杯中（电击杯冰上预冷灭菌），电击；

②电击结束，迅速加入1ml山梨醇，涂平板（在摇床上培养1h后涂平板也可）；

③MD华体会体育最新地址 生长3-4天，ROB华体会体育最新地址 上生长4-5天后，鉴定。

※电击注意点

①线性化质粒的含量在1-5ug，纯度越高越好，量要有保证，很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成；

②感受态菌液收集，确定OD值在1.2-1.5之间，可以稀释不同倍数，判断是否是线性关系，菌液浑浊单OD值不高，可能是OD稀释倍数不够；

③感受态保存，感受态制备但其他还没处理好，冰上放置的时间对转化效率也会有影响，因此还是那个原则：现做现用；且分装成每次够用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；

④电击杯清洗，先洗净吹干，浸泡在75%乙醇中，使用前超净台紫外灭菌，重复使用对实验也会有一定影响；

⑤电击参数，电压及电击时间可以摸索，适当增加电压或延长电击时间，电击过程冰上操作

毕赤酵母原生质体法转化及感受态制备

※原生质转化原理

※试剂配制

转化当天，配制如下溶液：

① SE：1M山梨醇，25mM EDTA，pH8.0

② SCE：SE：1M山梨醇，1mM EDTA，10mM柠檬酸钠缓冲液，pH8.5

③ SOS：1M山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl₂

④ CaS：1M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl₂

⑤ DTT，PEG：DTT水配制为1M浓度，PEG用水配制40%（w/v）

⑥ CaT：20mM Tris pH7.5,20mM CaCl₂

⑦ 藤黄节杆菌酶：用水配制成3mg/ml的浓度

⑧ 5%SDS溶液，RD融化琼脂100ml，1M山梨醇

每次转化时配制

① SED：19mlLSE加1ml DTT

② PEG/Cat：1:1混合40%PEG及Cat

其他试剂

① YPD华体会体育最新地址 1L，YPD平板1L

② RDB平板1L，RDHB平板1L

※感受态制备及消化细胞壁

①接种酵母受体菌单菌落于YPD平板，30℃培养2天；

②挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体华体会体育最新地址 中，30℃摇床震荡过夜；

③取培养的细胞5ul，10ul，20ul分别加入到含有200mlLYPD的液体华体会体育最新地址 中，30℃震荡过夜（300rpm）；

④第二天测每个培养瓶中的OD600值，并取出事先配置好的转化溶液，室温放置：

⑤收集OD600值在0.2-0.3对应的培养瓶中的细胞，室温离心（1500rpm5min左右），得到沉淀；如果没有培养瓶中的OD值在0.3左右的话，选择一个培养瓶，用新配置的华体会体育最新地址 以1：4稀释，再次培养（2-3h左右），直至出现OD值为0.2-0.3，收集细胞；

⑥准备去除细胞壁，准备去壁试剂和待去壁的细胞；

⑦准备去壁试剂：现配SED，保证DTT（分析级）的新鲜度，配完放-20℃；

⑧准备带去壁细胞：先用灭菌水清洗，转入离心管；1500rpm离心5min，收集细胞，用20mlSED重悬并洗涤离心；再次用1M山梨醇洗涤，离心（同上）；用SCE重悬，分开至两个离心管中（每管10ml左右）；

⑨准备藤黄节杆菌酶，取一管酶放置冰上，以上准备的两管细胞取出一管加入藤黄节杆菌酶，开始消化细胞（这一步可确定酶消化的最佳时间）；

最佳时间的确定：

1).准备20ml 5%SDS溶液分光光度计调至800nm，空白对照为800ul5%SDS及200ul SCE；

2).准备10个离心管，编号为0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50（根据时间编号）；

3).取上述8步中的另一管细胞，取出200ul加入至0号管中，放置冰上，此为0点；

4).加入7.5ul藤黄节杆菌酶在剩余的细胞中，轻混，30℃孵育（不要晃动）用来建立最佳时间所用

5).2min时取200ul悬浮液至2号管中，同理4,5,6,7,8min时重复操作，读样品OD800值；

6).用公式计算细胞去壁的效率：%去壁率=100-{（T时间OD800-0时间OD800值）x100}

10.计算出去壁率为70%左右时，得出最佳消化时间，同样操作加入7.5ul消化酶于另一管中消化细胞

11.室温离心去除悬浮液，1M山梨醇洗涤一次，0.6mlCaS悬浮细胞，立即转化，去壁的细胞应立即转化。

※转化毕赤酵母

①取100ul将去壁细胞，放入1.5ml离心管中（灭菌）；

②准备10ug线性化质粒（预冷）与去壁细胞混合，加入1ml新鲜PEG/Cat溶液，轻混，室温孵育10min；

③室温750rpm离心10min，去除PEG/Cat溶液；并用150ulSOS华体会体育最新地址 悬浮转化细胞，室温孵育20min；

④加入800ul 1M山梨醇，涂平板；

⑤取200ul转化细胞和RD（液体）混匀倒于RDB平板上，凝固后导致平板，30℃培养4-6天，出现转化子；

⑥取100ul稀释细胞，与RDH（液体）混匀，涂在RDHB上，凝固后倒置生长，30℃培养4-6天，出现克隆，表明去壁细胞可再次生长为分裂细胞。

阳性转化子的筛选与蛋白表达

※Mut⁺和Mut^s表型的判断

※Mut⁺的诱导表达

①挑取单菌落，摇菌，在25mlMGY或BMG或BMGY华体会体育最新地址 中，30℃，300rpm培养至OD600为2-6（培养15-18h左右观察）；

②室温2000rpm离心5min，收集菌体，用上述华体会体育最新地址 重悬，使OD600为1.0左右；将菌液至于1L摇瓶中，30℃300rpm培养，每24小时加入100%甲醇，至终浓度为0.5-1.0%；

③根据时间点取样（1ml）至于1.5ml离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；

④可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。

※Mut^s的诱导表达

①挑取单菌落，摇菌，在25mlMGY或BMG或BMGY华体会体育最新地址 中，30℃，300rpm培养至OD600为2-6（培养15-18h左右观察）；

②室温2000rpm离心5min，收集菌体，用上述华体会体育最新地址 重悬，使OD600为1.0左右；将菌液至于1L摇瓶中，30℃300rpm培养，每24小时加入100%甲醇，至终浓度为0.5-1.0%；

③根据时间点取样（1ml）至于1.5ml离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；

④可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。