单克隆抗体类药物（以下简称单抗类药物）是一类以免疫球蛋白G（IgG）结构为基础，由对称的2条重链及2条轻链可变区组成抗原结合结构域，可识别相应特异抗原的大分子蛋白类药物。随着生物技术的发展，单抗类药物制备技术日益完善，该类药物在整个医药卫生行业的地位显得日趋重要，越来越多的医药公司，尤其是国际性大公司，均在积极开展单抗类药物的研发和生产。目前，美国食品药品监督管理局（Food&Drug Administration，FDA）批准上市的单抗类药物已有60余种，另有超过300种处于临床试验阶段，主要应用于肿瘤、自身免疫病、心血管疾病及感染性疾病等多种疾病的治疗。国内大型医药企业在单抗类药物的研发能力和生产产能正处于迅速提升中，其中以上海君实生物医药科技股份有限公司旗下的苏州众合生物医药科技有限公司、信达生物制药（苏州）有限公司、苏州盛迪亚生物医药有限公司和百济神州生物科技有限公司尤为突出。除了已上市的阿达木单抗、贝伐单抗、曲妥珠单抗及多款PD-1／PD-L1单抗类药物外，以抗体药物偶联（antibody-drug conjugate，ADC）、双特异性抗体（bispecific antibody）、免疫检查点抗体（immune checkpoint inhibitor）为代表的新型单抗类药物也是目前国内外生物制药公司研究的热点。单抗类药物生产工艺及过程有别于传统化学药品，含有一些传统工艺中没有的杂质，存在一定质量风险，因此其质量控制要点及相应的检测方法与传统化学药品有较大差异。单抗类药物质量控制，尤其是杂质分析具有复杂性和多样性，有别于小分子药物，需通过多个维度对其分子进行表征分析才能确保其有效性、安全性和一致性。

1、单抗类药物质量标准的相关规定

目前，单抗类药物质量标准相关规定主要参照《中国药典》三部（2015版）、《中国药典》四部（2015版）通则、WHO相关定义与要求、人用药物注册技术要求国际协调会议（International Conferenceon Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）对生物技术产品、生物制品及生物类似药的相关规定、FDA和《美国药典》的相关技术指南、欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）相关技术规范制定。由于单抗类药物是新型药物，自2018年以来，虽国内已有多家企业陆续上市多个单抗类药物，但未被《中国药典》收载，均参照上述法规及指导原则执行各自注册标准。

2单抗类药物的检定

2.1性状与理化性质检定

单抗类药物是经细胞表达、纯化，制剂工艺后获得的。不同的制剂工艺、配方、存储及运输条件均会影响其分子间及分子内部共价键和非共价键的形成或打开，从而改变单抗类药物的性状与理化性质。因此，单抗类药物的性状与理化性质检定是其质量控制的必要环节，检定项目主要包括外观、复溶时间、装量差异、pH、可见异物、澄清度、不溶性微粒、摩尔渗透压、水分等。目前，单抗类药物的性状与理化性质检定标准多参照《中国药典》三部（2015版）及《中国药典》四部（2015版）通则制定。

2.2杂质的控制要点及相应分析技术

基于毛细管电泳技术（capillary electrophoresis，CE）的纯度和杂质分析《中国药典》四部（2015版）通则0542表明，CE是一类以弹性石英毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据分子电荷和分子质量大小不同实现分离的新型分离技术，是电泳与色谱结合的产物。单抗类药物是电荷异质性和分子质量相近的异种混合物，在产品生产及批放行过程均需确保其纯度及完整性，且无不需要的修饰发生。CE由于具有快速、灵敏、可靠等优势，已成为单抗类药物纯度和杂质分析中的必备技术。在CE的多种分离模式中，依靠等电点分离的毛细管等电聚焦成像电泳（imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF）、依靠电荷／质量比分离的毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）和依靠相对分子质量大小分离的毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis，CGE）是单抗类药纯度和杂质分析中最常用的3种模式。

单抗类药物分子的修饰，如糖基的唾液酸化、谷氨酸环化、二硫键的氧化等均会影响抗体的电荷异质性及等电点。iCIEF中电解质溶液形成pH梯度，各组分迁移至各自等电点时变为中性形成条带，给出蛋白质电荷异质性分布的信息。iCJEF在单抗类药物纯度和杂质分析中主要用于等电点的鉴定与电荷异质性的检查。与传统平板凝胶电泳比较，iCIEF具有耗时短、样品用量少、分辨率高、重现性好等优点。CZE中各组分根据各自的电泳流和电渗流按阳离子（酸性峰）、中性粒子（主峰）和阴离子（碱性峰）的顺序通过检测器。CZE在单抗类药物纯度和杂质分析中主要用于电荷异质性的检查。与iCIEF法比较，CZE用于电荷异质性分析更快速。同时，由于CZE所用缓冲液的紫外吸收低，可采用214nm波长紫外检测，比采用280nm检测的iCIEF具有更高的灵敏度。CZE用于电荷异质性分析的另一个优势在于其易于与质谱检测器连接，可为电荷变异体的结构分析鉴定提供重要信息。

目前，应用于单抗类药物还原和非还原性纯度分析（大小异质性）和N寡糖分析的CGE，由于样品蛋白质与十二烷基硫酸钠（SDS）结合形成复合物，这种模式也被称为SDS无胶筛分毛细管电泳（capillary electrophoresis-SDS，CE-SDS）。与SDS-PAGE比较，CE-SDS更快捷，耐用性更好，精密度及分辨率更高，且无拖尾峰、样品残留少、线性和重复性较高。由于CE-SDS检测无需对结果进行二次处理，其结果较SDS-PAGE更准确、稳定、客观，且CE-SDS法能将非糖基化重链与重链分离后对非糖基化重链进行定量分析。目前，CE-SDS主要采用紫外检测和激光诱导荧光检测两种检测方法。利用激光诱导荧光检测器检测痕量杂质的灵敏度更高。

近年，CE法开始涉及探索单抗类药物糖基分析领域，通过N糖苷酶F对单抗N糖进行酶切，再对酶切的N糖进行标记衍生，采用毛细管电泳结合激光诱导荧光检测器（capillary electrophoresis-laserin-duced fluorescence，CE-LIF）进行测定。与经典液相技术分析方法比较，CE-LIF的N糖标记前处理仅需1h，具有分析快速简便的优势。同时，可采用毛细管凝胶电泳结合激光诱导荧光检测器（capillary gel electrophoresis-laser induced fluorescence，CGE-LIF）技术分析宿主细胞残留DNA（host cell DNA，HCD）的分布。该方法的检测灵敏度明显高于ELISA法，其检测限低至6.25ng/uL，定量限低至25ng/uL。CE-LIF对酶切产物分离度高，在传统琼脂糖凝胶法有7个条带的情况下，CE-LIF获得了8个峰，且小于15000bp的片段分离度大于1.46，且其重复性也更好，迁移时间相对标准偏差均<0.35%，校正峰面积百分比均<5.65%。

基于高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC）的纯度和杂质分析作为现代药品检测的常用技术，在众多类型HPLC中，反相色谱（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、分子排阻色谱（size exclusion chromatography high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）和离子交换色谱（ion exchange chromatography high performance liquid chromatography，IEC-HPLC）已成为单抗类药物不同方面质量检定的常用技术手段。

RP-HPLC主要用于单抗类药物的肽图检查，《中国药典》四部（2015版）通则3405表明，通过胰蛋白酶裂解单抗类药物，形成肽段，采用RP-HPLC分析鉴定其一级结构的完整性和准确性。肽图是蛋白质及其酶解产物的指纹图谱，是单抗类药物质量控制和放行的必行检测。该项检测可监控单个氨基酸的突变、氧化、去酰胺化，也能检测单抗类药物N-末端环化、C-末端赖氨酸处理、N-糖基化等一系列非预期的表达变异。肽图分析包含4个主要步骤：蛋白的分离纯化、选择性酶切、多肽的色谱分离、多肽的分析和鉴定。肽图分析应得到足够的肽段和尽可能高的覆盖度以进行有效的分析，但该方法并未将二硫键还原处理成还原状态自由巯基的预处理步骤收录其中，如缺失上述步骤，采用胰蛋白酶裂解单抗类药物几乎得不到裂解峰。对于采用紫外检测器的RP-HPLC肽图分析，最重要的是具有足够大的分离度，以分离所有的组分峰，使用小粒径的长柱及超高效液相色谱系统（ultra performance liquid chromatography，UPLC）可大幅提高分离效率和速度。

《中国药典》四部（2015版）通则0514表明，SEC-HPLC可通过分子筛原理将蛋白质按多聚体、二聚体、单体及某些情况下出现的片段等小分子顺序分离，依次通过检测器。因此SEC-HPLC广泛应用于单抗类药物聚合物的检测，是目前常用的质控及放行检测方法。SEC-HPLC可定量，二聚体和聚集体的分离度较高，分析时间较短，且操作简单，可收集流分进行进一步分析。在SEC-HPLC分离中，样品将在1个柱体积内通过等度分离洗脱，因此，进样器、管路和检测器体积在内的液相系统总体积会影响分离效果。通常，与柱体积相关的液相系统总扩散体积越小，峰型越窄，分离效果越好。使用小粒径（3um）色谱柱比使用传统5um粒径色谱柱可获得更高的流速，且不影响分离度与柱效。除使用更合理的流动性pH之外，更小粒径的SEC-HPLC色谱柱能提供更好的分离度与更快的分离速度。

IEC-HPLC是考察单抗类药物电荷异质性的另一种手段，与CE比较，操作更简单，且能检测蛋白分子表面电荷分布差异的优势。弱阳离子交换色谱柱常用于测定单抗类药物存在的酸性电荷异构体（先于主峰出峰）与碱性电荷异构体（晚于主峰出峰）。这些电荷异构体多为主峰蛋白糖基化和去酰胺化的产物，但其有限的分辨率无法将各杂质精确分离，该缺点也限制了其在单抗类药物质量控制领域更深入地应用。随着质谱技术的发展，液相色谱与质谱联用技术在单抗类药物质量控制领域发挥着越来越重要的作用。四极杆-飞行时间（quadrupole time-off light，QTof）高分辨质谱、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-Tof-MS）及结合了高选择性四极杆离子过滤与Orbitrap高分辨准确质量数技术的QE高分辨质谱，在完整蛋白、肽图分析、寡糖分析、蛋白定量、蛋白测序等单抗类药物质量控制领域具有明显优势，见下表。

另外，亲水作用液相色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography high performance liquid chromatography，HILIC-HPLC）配以荧光检测器（fluores-cence detector，FLD）或电喷雾检测器（corona chaged aerosol detection，CAD）也在单抗类药物相关质量控制方面发挥着重要作用，如寡糖链分析与工艺中引入的表面活性剂与药用辅料检测等。随着多维液相色谱技术的发展，二维液相色谱（two dimensional high performance liquid chromatography，2D-HPLC）可将样品中难分离、需富集的杂质分离或富集用于与质谱、红外和核磁共振等的联用分析中，在单抗类药物杂质分离与鉴定等分析中发挥着越来越重要的作用。

细胞残留杂质分析单抗类药物除了进行常规的无菌试验、异常毒性、热源试验、内毒素等安全性检查外，其生产过程中HCP、DNA及纯化过程使用的亲和色谱ProteinA等工艺杂质残留量也需进行严格控制。这些由生产过程引入的残留杂质不仅影响产品的效价，还可能在不同程度上引起机体的免疫应答，最终引起过敏反应或毒性、免疫原性、致癌性等严重的安全性问题。

美国FDA规定，用一种灵敏度较高的方法检测药品的HCP，其含量应低于检测限（通常<100ppm）；《中国药典》三部（2015版）规定，CHO细胞HCP占总蛋白含量的0.05%以下。虽然目前国际上针对HCP的残留限度尚无统一标准，但ELISA法是与国际接轨的常用单抗类药物HCP及ProteinA残留的检测方法，也是目前《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》中推荐的检测方法，但ELISA法在《中国药典》四部（2015版）通则并未收载。另外，质谱检测在HCP定量也有所应用，BOMANS使用Orbitrap高分辨质谱监控纯化过程中的HCP含量变化，并在最终药物中鉴定到多种低丰度的HCP，对纯化方法的优化具有重要的参考意义。

WHO及国内外药物监管机构要求，CHO宿主细胞DNA残留量应不高于10pg。《美国药典》（USP41-NF36版）指出，定量PCR法（q-PCR）的适用性较其他检测方法更好。q-PCR法对样品的前期处理要求较高，但我国尚未建立统一的国家药品质量控制标准核酸信息平台和DNA残留量标准检测方法，单抗类药物中CHO宿主细胞残留DNA的检测均由各生产厂家自行检测。宿主细胞DNA残留国内外常用的q-PCR法在《中国药典》四部（2015版）通则中也未收载。

随着单抗类药物研究的深入及分析技术的发展，质量源于设计（quality by design，QbD）质量控制理念的推广，单抗类药物杂质分析正向自动化、高特异性、高准确度、高灵敏度、微型化及高通量实时快速检测的方向发展，如芯片实验室（Lab-On-Chip）技术在杂质残留检测领域不断发展与探索；自动化处理平台高通量蛋白纯化、酶解、脱盐、多肽分级、糖链富集等自动化流程日趋成熟；高分辨质谱（high resolution mass spectrometry，HRMS）定性定量技术在过程开发及批放行中的逐渐普及。这些分析技术的发展正推动着越来越多的新技术、新方法在单抗类药物杂质分析领域得到应用。同时，随着单抗类药物的临床应用，出现了越来越多的不良反应，对引起这些不良反应的相关杂质的深入研究将对单抗类药物的有效性、安全性和一致性的提升起到推动作用。