一．退化原因

1．有害突变及细胞遗传学原因

根据细胞生物学观点，细胞变异和分裂速度密切相关，分裂速度越快，变异将会越多。微生物由于分裂速度很快，分裂中的变异数量将会增加，而菌种退化与细胞变异密切相关。据有关数据统计，通常每三百个细胞中，就会出现一个变异。在多代传代繁殖中，变异概率将会更高。当菌种遗传物质发生变异之后，突变体往往更能适应外界环境条件，变异的细胞再分裂，变异体将会越来越多，直到最后代谢能力完全退化。

2．生理代谢方面的原因

菌种制备时，菌体培养在特定的华体会体育最新地址 上，这些华体会体育最新地址 通常具备菌种生长、发育及繁殖所需的营养物质，如蛋白质、糖类、生长因子及水等。但是，由于各种营养物质的配比不一定最优，即使一个优良的菌株，如果长期使用基本相同的华体会体育最新地址 ，其营养不能达到生理要求，长此以往培育下去，必然造成营养不良。除了培养成分配比之外，培养环境也是重要方面，如果对其控制不当，将会严重影响菌种的生长繁殖。比如微生物培养时，通常会分泌多种胞外酶，如纤维素酶、果胶酶及半纤维素酶等，以分解有机物进而获得营养及能量，当培养条件不适合时，这些酶类分泌量会大幅度减少，导致营养物质无法利用，从而生长停止，如果这种情况长期发展下去，将会导致菌种退化。

3．保藏方式不当或长期保藏

目前国内外公认防止菌种退化的最好办法是采用液态氮超低温保藏。此外，菌种长期保存或长期使用后，菌丝长势减弱，容易提前出现老化现象。一般的保藏方法，菌株虽在低温下保藏，但并未完全停止其生命活动，仍然存在着变异的可能。

4．菌种混杂

在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致不同品种的菌丝体混杂在一起，造成原有品种生产性状的改变，常常表现出产量下降、质量变劣等退化现象。

5．宿主（感受态）老化

对于基因工程菌来说，菌种退化是一个无法回避的问题，也是影响正常发酵生产的最大障碍。其具体表现形式一般为发酵早期溶菌、菌体生长缓慢、糖代谢异常、发酵OD低以及酶活（效价）差等，严重影响了发酵批次的稳定性。对于工程大肠杆菌来说，其异常表现与污染噬菌体有类似之处，判断起来有一定的迷惑性。而究其原因，大多数情况是由于宿主感受态自身发生老化或退化引起。这种情况下，即使更换发酵设备或者对发酵环境全面净化处理也无济于事。

二．菌种退化的预防及其复壮措施

1．定期分离菌种,以达到纯化效果

在菌种培养中，为了保证菌种质量，每隔1至2年，必须对原菌种进行分离。菌种纯化是常用的一种复壮方法。原理是定期分离菌种，将退化的菌种分离剔除，挑选出具有优良性状的菌株在适宜的华体会体育最新地址 上培养，恢复菌种原有的生长状态，再进行扩大培养。

2．控制菌种传代次数

由于菌种退化和传代次数密切相关，应在培养中给予重视，一般情况下，代数不能超过5代。菌种在多次传代过程中会发生少量基因的突变，到突变达到一定程度时，就会造成遗传物质的改变，然而频繁传代一般都是负变异占绝对优势。因此，控制菌种的传代次数也是防止菌种退化和维持原有性状的有效措施之一。

3．采用适宜的保藏方法

建议采用液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是将需要保藏的菌种和保护剂按一定的比例放于冻存管中，再将冻存管保藏在超低温液氮中。常用的保护剂有甘油、血清蛋白、二甲基亚矾、聚乙烯氮戊环、糊精、吐温80等，不同的菌种要根据自己的特性选择不同的保护剂。在超低温环境中菌种几乎丧失了代谢功能，保持了菌株原有的性状，变异的可能性也大大降低，这种方法对大部分菌株都适用，且保存时间长达数年。具体操作方法：把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中（ 在塑料瓶的底部放一块重物，使塑料瓶连同安瓿管能一起沉入液氮罐中），盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种。把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管缓慢地降温，大约30分钟后，把安瓿管浸入液氮中进行长期保存。启用液氮罐中保存的菌种时， 应先将安瓿管置于35~40℃的温水中，使瓶内的冰块迅速融解，然后在无菌条件下开启安瓿管，用接种针取菌块移接于适宜的华体会体育最新地址 上活化培养。

4．菌丝尖端分离

挑取健壮菌丝体顶端部分进行纯化培养，以保持菌种的纯度，使菌种恢复原来的生活力和优良种性，达到复壮的目的.

5．适当更换华体会体育最新地址

长期在同一华体会体育最新地址 上继代培养的菌种，活力可能逐渐下降。在菌种保藏传代中，经常改变华体会体育最新地址 成分，或在原有的华体会体育最新地址 中添加酵母膏、麦芽汁、氨基酸类物质和维生素等，以刺激菌丝生长，提高菌种活力。

6．更新原始宿主菌

工程菌出现菌种退化问题后，技术人员常用的对策是重新转化保种，误以为这样可以解决问题，这种做法对有些退化情况或者短期内可能有一定效果，但其实并不能彻底解决问题，类似发酵异常问题往往还是周而复始反复出现。需要明白的是，宿主本身也是菌种，也存在老化退化问题，只有更换原始出发宿主菌，并更新其相应感受态，然后再转化保种，才有可能根治顽疾。

三．酵母菌纯化复壮流程举例

①菌种活化：将酵母菌种接种在5 % YPD 固体斜面上，30 ℃恒温培养1 d， 重复2 次。用灭菌牙签挑取适量活化的酵母菌斑接种于5 mL 液体YPD 华体会体育最新地址 中，于30℃、200 r/min 摇床震荡培养12～16 h，此时可达到对数生长期。

②初筛：取上述活化菌液100 μL，置于5 mL PDA 华体会体育最新地址 3 种不同的液体华体会体育最新地址 中，于30℃、200 r/min 摇床震荡培养12～16 h，分别稀释为10 万倍和100 万倍2 个浓度梯度， 取50 μL 稀释液涂布到相应的固体PDA 华体会体育最新地址 平皿中，30 ℃恒温培养2 d， 观察并记录菌落生长情况。

③复筛：挑出光滑圆润、色泽乳白、形状规则且较大的菌斑，用牙签挑取少许置于5 mL PDA液体华体会体育最新地址 中，30 ℃ 200 r/min 摇培过夜。取1.5 mL 菌液3500 r/min 离心5 min 得菌体，加入1 mL PDA液体华体会体育最新地址 重悬，山梨醇、甘油处理过夜。取1 mL 处理后的菌液离心得菌体，分别加入1 mLPDA液体华体会体育最新地址 重悬，稀释10 万倍后涂布在固体PDA华体会体育最新地址 上，30 ℃恒温培养，3 d后观察记录。

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