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前言

Poly A尾巴几乎存在于所有的真核生物中，组蛋白是目前唯一已知的可以转录加工产生末端不携带poly A尾巴的mRNA。在细胞核内，mRNA经转录产生后，需要马上经过一系列加工处理完成末端修饰，此过程称为RNA processing。mRNA转录后的修饰对于其从细胞核内输出到成功翻译表达出蛋白的一系列过程来说是必需的。

此文先介绍了mRNA ploy A尾的形成机制、生理功能，然后针对mRNA poly A尾巴序列缩短、半衰期短等问题，结合文献给出了相应的优化方案。

细胞内mRNA 3′末端poly A尾巴形成机制

几乎所有真核生物mRNA 3'末端的修饰都是通过核酸内切酶切割和添加poly A实现的。在哺乳动物细胞种，这种修饰反应依赖于切割位点上游的AAUAAA序列，切割位点下游的富含GU或者U的序列以及AAUAAA序列上游的刺激序列。在AAUAAA序列和下游富含U序列之间发生核酸内切酶切割，从而产生一个末端含有3'OH的上游序列和一个末端含有5'磷酸基因的下游序列。上游序列末端发生聚腺苷酸化，添加上poly A尾巴，下游序列被降解掉（图1）。因此，poly A尾巴并不存在于基因中，而是pre-mRNA 3'末端发生内部切割后聚腺苷酸反应的终产物。在真核细胞中，尾巴长度的变动范围可以从酵母中的90个腺苷酸到哺乳动物中大概250个腺苷酸^[¹^]。

图1 pre-mRNA 3'末端经核酸内切酶切割后发生聚腺苷酸反应生成poly A尾巴

mRNA poly A尾巴的生理功能

mRNA的多聚腺苷酸化为多种核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）提供了结合位点，如poly A结合蛋白（polyadenylate-binding protein，PABPC）。Poly A尾巴及其相关蛋白在胞质中介导mRNA降解的同时保护细胞核中的mRNA不受酶的破坏。

图2 mRNA闭环翻译模型

Poly A尾巴除了在mRNA转换中起作用外，在mRNA翻译中也起着重要的作用。真核生物存在一个常见的翻译模型：mRNA闭环翻译模型（图2），其认为真核翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）可以结合mRNA的5'端poly A尾，进而将mRNA形成闭环，结合多个核糖体，以提高效率。

mRNA poly A尾巴的设计

Poly A尾巴与PAPB结合，PAPB跟翻译起始因子eIF4G相互作用，使得mRNA形成“闭环”结构，有助于募集40S翻译起始复合物到mRNA上，与5'末端帽子结构协同作用，共同刺激翻译起始。Poly A尾的长度显著影响其与PABP的结合能力。

耀海生物设计的poly A尾分布均一，poly A尾一体化转录形成，分布更为均一。关于此方面的问题，大家可以文末查看菌菌的联系方式。

关于poly A尾的设计主要有以下几点：

1.哺乳动物的poly A尾平均长度约为200nt，其在酵母中平均约70nt；
2.Poly A尾长度并非恒定不变，poly A尾中也可以含有非A的核苷酸组分来抑制mRNA的衰变降解途径；
3.Poly A尾长度、翻译效率和mRNA稳定性之间并不是简单的线性关系；
4.非洲爪蟾卵母细胞：32nt以上的poly A尾在翻译效率上就等同于150nt长度的poly A尾，但当poly A尾长度不足16nt时，mRNA无法翻译。

mRNA poly A尾巴的优化

1.避免poly A尾巴缩短

在细菌扩增过程中，携带长的聚均核苷酸序列的质粒会产生不可预测的重组事件，质粒上的poly A尾巴随着细菌的不断扩增发生缩短，这会对携带过长poly A尾巴质粒的克隆和扩增造成麻烦，因此研究人员展开对携带poly A尾巴的质粒进行一系列的改进，希望可以找到避免poly A尾巴缩短的方法。

图3 在质粒转化培养过程中poly A尾巴缩短，poly A尾巴越长，越不稳定。

2016年，Kyle Jacoby等人^[²^]发表文章peVl: A linear Plasmid for generating mRnA IVt templates With extended encoded Poly(A) sequences，首次研究携带不同长度poly A的质粒在细菌扩增过程中尾巴的长度稳定性情况，他们发现，poly A尾巴长度是72 bp时，转化细菌，过夜培养后，其长度可以保持不变；当poly A尾巴加长到172 bp时，随着质粒扩增，自发的删除突变开始出现；当poly A尾巴达到更长的325 bp时，此时极度不稳定，甚至很难获得阳性的克隆子（图3）。为了消除环形质粒上ploy A尾巴的不稳定性，Kyle Jacoby等人将不同长度的poly A尾巴插入克隆位点，开发出基于N15噬菌体的pEVL线性质粒系统，该系统源自PJazz质粒。PJazz质粒是一种用来克隆含有重复或者不稳序列基因组的线性质粒系统。结果发现，与传统环形质粒相比，在连续传代培养的过程中pEVL质粒上poly A尾巴长度的维系有着显著优势，甚至当尾巴长度达到500bp，可以成功获得携带500bp Poly A尾巴的质粒克隆子。

图4 间隔poly A序列会减少质粒培养过程中引发poly A序列缩短的重组事件发生的概率

2019年，Zeljka Trepotec等人^[³^]发表文章Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life，发现把poly A序列间隔开来，可以显著减少质粒DNA扩增时的重组事件，维持尾巴长度，同时不影响体外转录生成的mRNA的翻译效率和半衰期。

PAPB需要的最短结合位点序列长度是12nt，但是单个的PAPB分子结合到mRNA上是不足以启动蛋白翻译的。寡聚PAPB以占据27-30nt重复单位的方式结合mRNA poly A尾巴上。目前最长用的poly A序列长度是120nt，因此要确保间隔的poly A序列上至少结合一个寡聚PABP，所以在设计间隔poly A序列长度是选择40nt，这样的话，120nt poly A尾巴可以分成2个60nt或者3个40nt，中间用Spacer序列分割。经过一系列的测试，发现携带间隔poly A尾巴序列的质粒，在培养过程中重组事件发生显著下降，而且不会对该质粒转录生成的mRNA的蛋白翻译效率和稳定性造成影响（图4）。Pfizer-BioNTech公司就使用此策略在A₃₀和A₇₀之间用10个碱基GCATATGACT连接，开发了针对SARS-CoV-2的疫苗BNT162b2。

2.延长mRNA半衰期

近日，香港科技大学旷怡团队^[⁴^]在Molecular Therapy发表了题为“Cytidine-containing tails robustly enhance and prolong protein production of synthetic mRNA in cell and in vivo（含胞嘧啶核苷尾可显著增强细胞和体内合成mRNA的蛋白质产量，并延长半衰期）”的研究，本研究通过对尾部非A核苷酸的系统替代实验，首次证明含胞苷C序列作为合成mRNA的尾部可提高合成mRNA的表达强度和表达时间。此外，C取代还可以抵抗mRNA的降解，从而延长其半衰期。

图5 尾部末端的核苷酸取代对mRNA翻译的影响

为了研究尾部的非A核苷酸对mRNA蛋白质产生的影响，本研究首先合成了一系列具有40nt尾的EGFP mRNA，在3'端或附近进行不同的单核苷酸替换（图5A）。转染后24 h的相对表达分析（所有mRNA的表达峰值）显示，EGFP-38ACA可显著提高蛋白产量（图5B）。

为了证实C替代对蛋白质表达的促进作用，本研究构建了尾部具有双C替换的EGFP mRNA。结果表明，在尾部末端附近有相邻或分离的双C取代的mRNA都比有40A或38 ACA尾部的mRNA产生更多的EGFP，而尾部末端的双C取代只会导致蛋白质产量的轻微增强（图5C）。

在所有检测的细胞系中，尽管这些细胞系具有不同的基础蛋白表达水平，但EGFP-37ACCA和EGFP-36ACACA产生的EGFP量明显高于EGFP-40A（图5D）。无论细胞系间蛋白质表达增强程度的差异如何，数据都明确指出，尾部末端附近的C取代通常可以诱导合成mRNA的蛋白质表达增强。

结语

3'端的poly A尾巴可以保护帽结构不被降解，与poly A结合蛋白、5' Cap（帽结构）和翻译起始因子蛋白协同作用，启动蛋白质的翻译。因此poly A尾的序列设计与优化也是相当重要的。今天菌菌给大家详细解析了poly A尾序列的设计与优化，希望能够在质粒发酵生产中避免poly A序列发生碱基丢失造成尾巴缩短以及延长mRNA的半衰期。如有poly A尾相关问题，可私信菌菌：13380332910（微信同号）。

参考文献：

[1] WAHLE E, R EGSEGGER U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes [J]. FEMS microbiology reviews, 1999, 23(3): 277-95.

[2] GRIER A E, BURLEIGH S, SAHNI J, et al. pEVL: A Linear Plasmid for Generating mRNA IVT Templates With Extended Encoded Poly(A) Sequences [J]. Molecular therapy Nucleic acids, 2016, 5(4): e306.

[3] TREPOTEC Z, GEIGER J, PLANK C, et al. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life [J]. RNA (New York, NY), 2019, 25(4): 507-18.

[4] LI C Y, LIANG Z, HU Y, et al. Cytidine-containing tails robustly enhance and prolong protein production of synthetic mRNA in cell and in vivo [J]. Molecular therapy Nucleic acids, 2022, 30: 300-10.

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