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背景介绍：在上世纪50年代末期，人们从非人灵长类动物中首次鉴定出猴痘病毒（monkeypox,MPXV）。猴痘是一种人畜共患病，1958年首次在用于研究的猴子中发现，主要在动物中传播。1970年首次在刚果（金）发现人类猴痘病例，此后猴痘一直在非洲的一些国家流行，包括尼日利亚、刚果（金）和中非共和国等。在天花疫苗接种停止后，猴痘病毒便一直在中非和西非的人群中自限性传播。2003年，野生啮齿动物进口导致美国爆发猴痘病毒，感染人数超过70人，甚至直接导致一个年轻孩童住院。过去由于猴痘病毒的人际传播能力非常有限，这些疫情都很快被遏制。而如今猴痘病毒传播能力增强，猴痘疫情在全球超过29个国家爆发，导致将近80000例感染人数，52人死亡，给世界卫生公共安全带来新的挑战。关于猴痘相关知识菌菌此前进行过一些介绍，详见【耀文解读】mRNA篇|mRNA猴痘疫苗100%保护小鼠免受感染：中国生物最新研究、【对症创药】猴痘将至，不注意可是要毁容的哟——猴痘你必须要了解的二三事。
2022年12月19号，Bernard Moss等人在bioRxiv上传文章：A monkeypox mRNA-lipid nanoparticle vaccine targeting virus binding, entry, and transmission drives protection against lethal orthopoxviral challenge，旨在测定编码猴痘病毒4种高度保守表面蛋白的mRNA疫苗是否能够诱导机体产生同MVA减毒疫苗相同的免疫保护效果，现在菌菌带大家探寻答案。天花疫苗（JYNNEOS）是一种减毒的改良牛痘安卡拉毒株(MVA) 。在许多流行病学研究和动物模型中，人们已经证实接种天花疫苗可以减轻猴痘感染疾病症状。在接种过一或两次天花疫苗的人群中，已经出现猴痘病毒的突破性感染，说明当前的天花疫苗无法提供完全免疫保护。猴痘病毒具有广泛的动物宿主和持续进化的潜能，因此当前迫切需要研发出有效的预防性新型疫苗。免疫相关性分析显示体液免疫在预防痘病毒（orthopoviral）感染时作用非常。尽管存在强烈的CD8+T细胞免疫，缺乏B细胞的小鼠在感染痘病毒之后依然会出现严重的疾病。类似的，在非人灵长类动物模型中，缺乏B细胞则会导致猴痘病毒突破性感染。同时有研究显示，疫苗接种者血清中产生的牛痘免疫球蛋白能够预防天花病毒感染。然而，在一项涉及癌症病人的研究中，高免疫活性抗体对于天花病毒的免疫保护依赖于补体激活，这表明仅仅依靠抗体不足以实现完全的免疫保护，而体外抗体中和作用并不总是与体内免疫保护相关，反之亦然。NK细胞在控制猴痘病毒感染方面起到的关键作用，加之痘科病毒基因组中与补体逃逸相关的大量基因元件，这些信息均表明中和和非中和抗体在痘科病毒的控制和清除方面作用很大。免疫数据显示痘科病毒的一系列表面蛋白高度保守，靶向这些表面蛋白时能够阻断病毒感染，借助Th1细胞免疫反应，赋予机体免疫保护。痘科病毒存在两种感染形态，一种是细胞内成熟病毒粒子（MV）；一种是细胞外包膜病毒粒子（EV）。猴痘病毒的牛痘抗原同源物M1和A29是涉及入侵细胞相关的胞内成熟病毒粒子上面的表面蛋白，而A35和B6是与病毒传播相关的细胞外包膜病毒粒子上面的表面蛋白。在小鼠和非人灵长类动物模型中，用猴痘病毒进行攻毒测试，这些表面蛋白能够提供完全的免疫保护。

猴痘病毒mRNA疫苗抗原设计

考虑到痘科病毒复杂的生活周期，牛痘病毒抗原包含各来自MV（A27和L1）和EV(B5和A33)的两种抗原才能提供免疫保护，因此与牛痘病毒抗原氨基酸序列相似度分别为94.6%、98.4%、96.5%、95%的4种猴痘病毒抗原被选作疫苗抗原:A29、M1、B6、A35。研究人员对4种猴痘病毒抗原进行修饰，以提升抗原表达效率：A29是一种分泌型蛋白，添加有来自流感病毒H1的信号肽，并除去了所有的N连接的糖基化位点和Cys；在M1蛋白序列中添加来自流感病毒H1的信号肽，将M1蛋白序列中的Ser/Thr突变为Ala，从而移除所有的N-连接糖基化位点，并将M1蛋白序列中的胞质域截短（残基208后面）；将B6蛋白的胞质域截短（残基303后面）；在A35蛋白序列中添加来自流感病毒N2的N末端跨膜结构域以替代野生型的胞质和跨膜域（头59个氨基酸）。流式细胞仪显示修饰过的猴痘病毒抗原表达量均得到提升。

图1：A-D：牛痘病毒（VACV）和猴痘病毒（MPXV）A27/A33/B5/L1同源蛋白氨基酸序列相似性比较；E-H：Alpha-fold预测猴痘病毒疫苗抗原结构，包括A29(E)、A35(F)、B6(G)

图2：mRNA编码的膜结合型和分泌型猴痘疫苗抗原表达分析。A:流式细胞仪分析B6、A35、M1膜结合型抗原的表达；B:分泌型A29抗原的免疫印迹胶图

猴痘病毒mRNA疫苗免疫原性

抗体反应将编码猴痘抗原（A29,M1,B6,A35）的mRNA疫苗采用肌肉分别注射到小鼠体内，间隔3周，接种2剂，收集血清，测定中和抗体滴度。在这些小鼠中，编码M1的疫苗诱导小鼠产生的血清中和抗体滴度最高，并显著高于接种编码A29的猴痘mRNA疫苗及接种天花疫苗MVA的小鼠。来自胞外包膜病毒粒子（EV）的B6和A35不触发能够中和细胞内成熟病毒粒子（MV）的中和抗体，因此研究人员在设计抗原组合时，是希望引入的其他抗原不会干扰或者减少由M1和A29触发的抗体水平的。当小鼠接种由M1+A35/B6组合的猴痘mRNA疫苗时，剂量高（8ug）或低（2ug）都能触发靶向MPXV的高滴度抗体，这说明引入B6或者A35不对MPXV中和作用造成干扰（图3.A）。研究人员发现不同剂量（2ug/8ug）的mRNA疫苗触发的靶向A29和A35抗原的血清结合抗体滴度差异要比靶向M1和B6抗原的更加显著。与此形成鲜明对比的是，接种天花疫苗MVA的小鼠血清中几乎检测不到靶向4种MPXV抗原的IgG，这说明MVA疫苗所触发的中和作用可能靶向的是许多不同的抗原决定簇，而不是专门靶向A29/M1/A35/B6(图3.B)。接下来，研究人员发现接种4价猴痘mRNA疫苗触发强烈的Th1依赖型的IgG2a反应，低水平的IgG2b,IgG1以及IgG3反应，并伴随强烈的Fc依赖的效应作用：包括抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP），抗体依赖的中性粒细胞吞噬作用（ADNP），抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）以及抗体依赖的补体沉淀作用（ADCD）。这些数据说明，mRNA疫苗能够触发强烈的Th1偏向性的体液免疫，伴随强烈的Fc受体效应，这与MVA天花疫苗触发的体液免疫形成明显差异（图3.C）。

图3：猴痘mRNA疫苗和天花疫苗VACA触发的不同抗体反应
VACA牛痘病毒攻毒测试研究人员采用MVA天花疫苗和3种不同的mRNA猴痘疫苗免疫小鼠（二/三/四价），免疫三周后鼻腔接种VACA牛痘病毒（106PFU），进行攻毒试验。所有未接种疫苗的小鼠在7-10天均出现严重的体重减轻现象，相反，所有接种MVA天花疫苗的小鼠尽管出现短暂的体重减少，但均能在致死剂量牛痘病毒感染的情况下存活。形成鲜明对比的是，接种8ug mRNA疫苗的小鼠均能够存活，并且体重并未减轻。类似的，接种2ug mRNA疫苗的小鼠均能存活，体重仅短暂减轻（图4.A/B）。考虑到二价(A35/M1)和三价（A35/B6/M1）mRNA猴痘疫苗均能够触发高滴度的中和抗体，研究人员测试了在致死剂量牛痘病毒感染的情况下，二价或三价疫苗是否提供足够的免疫保护。结果发现，同四价类似，二/三价疫苗接种小鼠均能够存活以及出现相似水平的抑制体重降低的作用（图4.A/B）。不同剂量的mRNA疫苗触发的中和抗体和结合抗体反应是不相同的。对于四价疫苗来说，高剂量和低剂量mRNA疫苗触发的靶向A29L和A35R的特异性结合抗体反应明显存在剂量依赖；相反，M1和B6的抗体反应在不同剂量mRNA疫苗中存在强烈的保守性(图4.C/D)。

图4：B6和M1猴痘mRNA疫苗独立于剂量的免疫保护作用
M1小鼠能够触发强烈的靶向MPXV和VACV成熟病毒粒子的中和抗体反应，A29 小鼠触发中等程度。相反，B6小鼠仅产生极微弱的中和抗体滴度，但却能减少VACV包膜病毒的传播。与对照组PBS相比，来自A29小鼠的血清对VACV包膜病毒的传播没有任何影响；来自M1 mRNA疫苗和MVA天花疫苗免疫小鼠的血清对于VACV包膜病毒的传播仅仅存在微弱的阻断作用。尽管编码各自抗原的疫苗在高剂量的情况下免疫小鼠能够触发高滴度的IgG1，但在低剂量下，除了抗体阻断病毒传播能力的差异，编码不同抗原的疫苗触发的抗体滴度、抗体类别及Fc受体结合水平均存在明显差异。用0.5ug/2ug的编码M1/B6/A29抗原的猴痘mRNA疫苗免疫小鼠，进行VACA攻毒试验。结果发现，所有接种疫苗的小鼠均体重减少，但大多数接种B6/M1的小鼠体重出现恢复现象。与0.5ug剂量组相比， 2ug的B6/M1小鼠体重在第7天-17天体重降低的幅度更小，所有接种低或高剂量A29的小鼠均死亡（除一个小鼠幸存外），而且高剂量A29小鼠体重减少曲线和未接种疫苗小鼠的是完全重叠的。以上数据说明，尽管M1和A29猴痘mRNA疫苗均能够触发靶向MV病毒颗粒的中和抗体，但是只有单独接种M1才能够免疫保护。此外，研究人员还发现对于低剂量和高剂量A29小鼠接种组来说，靶向VACA的中和抗体效应和抑制小鼠体重减少两者之间并不存在关联性，但在高剂量M1小鼠接种组中情况完全相反。尽管B6无法触发靶向MV病毒颗粒的中和抗体，但其所触发的抗体能够减少EV病毒颗粒的传播，这解释了B6与M1能够实现相似免疫保护。以上结果说明疫苗触发的不同抗体的病毒阻断作用在预防痘科病毒感染方面起着至关重要的作用。

图5:编码不同抗原的猴痘mRNA疫苗触发的抗体在阻断病毒传播方面存在显著差异

结论

自天花疫苗出现以来，利用牛痘病毒作为免疫原，人们已经开发出三代基于VACV牛痘病毒的天花疫苗。随着mRNA疫苗平台的出现，使得人们能够快速递送病原体相关的抗原来激活机体免疫系统。在这项工作中，研究人员证实采用设计猴痘病毒附着、侵入及传播，表明蛋白作为mRNA-LNP疫苗编码抗原能够触发小鼠产生猴痘病毒特异性的免疫反应，并在VACV牛痘病毒致死剂量攻击下能够提供异源的免疫保护，使疫苗接种小鼠免于死亡。与减毒疫苗MVA相比，mRNA猴痘疫苗能够触发更优越的中和抗体反应和抑制MPXV和VACV病毒细胞间传播的能力，以及诱导产生更强烈的靶向4种抗原的偏向Th1的体液免疫反应。编码单个MPXV抗原的mRNA猴痘疫苗提供针对VACV病毒的部分免疫保护，而编码2种、3种或4种MPXV抗原组合的mRNA猴痘疫苗能够组织猴痘感染相关的体重减轻和死亡。借助于中和抗体和非中和抗体的组合效应，多价猴痘mRNA疫苗提供的交叉免疫保护优于MVA天花疫苗提供的同源性的免疫保护。
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