用于重组DNA技术中的宿主细胞既有原核生物，又有真核生物，典型的宿主细胞如：大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母等。在重组基因工程菌培养过程中，遇到的主要问题有：1)有机酸类代谢副产物积累并抑制菌体生长和产物的表达；2)大规模及高密度培养过程的供氧限制；3)外源基因高表达引起宿主细胞生理负担过重；4)质粒不稳定性问题。其中，质粒的稳定性研究尤为重要，对于一定结构的基因工程菌而言，提高质粒的稳定性对于基因产物的生产及科学研究具有重要意义。对基因工程菌而言，基因工程菌的不稳定性将导致得不到理想的产量，甚至得不到预期的目标产物。

一、质粒不稳定性的定义及类型

重组质粒的不稳定性，是指重组菌在培养过程中发生突变或丢失，结果使重组菌失去了原有的表型特征。依据重组质粒的变化本质，质粒不稳定性可分为结构不稳定性、分离不稳定性。质粒的结构不稳定主要是由于DNA的插人、缺失或重排等引起的不稳定，使目的基因功能丢失，但对质粒主要遗传标记丢失影响较小，质粒的分离不稳定是细胞在分裂后分离时引起的不稳定，由于质粒在子代细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含质粒，是质粒丢失的主要原因。质粒的分离不稳定性常出现在两种情况，一是传代质粒只在许多世代之后才明显产生丢失2；二是带有质粒的细胞与无质粒细胞有不同的生长速率导致。外源基因载体DNA的存在犹如细胞内存在多拷贝的质粒一样，对宿主是一种代谢负担，当外源基因大量产生特异蛋白时，这种代谢压力就变得更加严重。一般条件下，带有重组质粒的宿主菌的生长速率低于无质粒的细菌，由此，质粒的稳定性伴随着生长速率的不同而变化。基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大的影响，在连续培养时，发现在低比生长速率下重组质粒只可以完全维持20代，在复合华体会体育最新地址 和基本华体会体育最新地址 中，重组酿洒酵母的质粒稳定性和比生长速率的关系不同。在葡萄糖限制的复合华体会体育最新地址 中，质粒丢失速率随稀释率的增加而增大，但是在葡萄糖限制的基本华体会体育最新地址 中则相反。因此，质粒的稳定性与生长速率的变化相关。

二、质粒不稳定性的影响因素

1、 宿主细胞的遗传特性

重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。相对而言，重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，在枯草杆菌和酵母中较不稳定，但是也有例外。

2、质粒的特性

在重组菌细胞中，质粒载体的大小与拷贝数是影响质粒分离不稳定的重要因素。插入DNA片段的大小及特性等在质粒分离不稳定性中有关系，一般小的片段质粒比较稳定。对于松弛型质粒载体，一般情况下，伴随着细胞分裂，质粒以随机方式分配到子粒细胞中，质粒拷贝数越高，出现无质粒载体细胞的概率就越低，质粒就越稳定，而质粒载体的寡聚化效应会导致质粒载体拷贝数大大降低，从而加重质粒的分离不稳定性。

3、调控突变、培养条件等

外源基因的调控突变、培养条件及质粒中所携带的外源基因性质、重组菌的生长速率、外源基因的表达水平等因素都是影响质粒稳定性的因素，有些需要在质粒设计和构建时仔细考虑，有些则与培养过程有关：1）基因工程菌生长的最适温度往往与发酵温度不一致，在发酵过程中，不仅要考虑生长速率，还要考虑发酵速率、产物生成速率等因素，例如大肠杆菌往往在30°C左右质粒稳定性最好，而生长最适温度为37°C；2）基因工程菌的生长和质粒稳定性的pH值有的也存在差异。

三、提高质粒稳定性的策略

1、 质粒的选择

为了构建稳定的结构体，最好利用小的质粒，小的质粒在高密度发酵中遗传性状比较稳定，而大的质粒往往由于发酵环境中各种因素的影响，而出现变异的几率较高。

2、选择合适的插入片段或重新构建表达载体

插入DNA片断的大小，在质粒分离不稳定性中有关系。当酶切同源和外源染色体DNA，得到大小不同的片断，与穿梭质粒pwB110重组。得到两个重组质粒，转入枯草杆菌后，重组质粒的稳定性，表现出和插入DNA片断大小有关。而转入大肠杆菌，重组质粒却不表现出这种相关性。

3、选择适当的宿主细胞

重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。相对而言，重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，在枯草杆菌和酵母中较不稳定，但是也有例外。同一宿主菌株对不同质粒的稳定性不同，而同一质粒在不同宿主菌株中的稳定性也有差别。因此对于不同的表达系统、外源基因表达产物的性质、表达产物是否需要进行后加工及其复杂程度将决定宿主菌的选择，如真核或原核生物、蛋白酶缺陷型或营养缺陷型等的宿主菌。

4、添加选择压力

重组菌的稳定性受遗传及环境因素两方面的控制，所以可以通过基因水平的控制来限制反应器中无质粒细胞的繁殖以提高系统中含质粒细胞的比例。在重组菌培养过程中通常采用增加“选择压力”来提高重组菌的稳定性。“选择压力”通常包括：1)在质粒构建时，加入抗生素抗性基因，在生物反应器的华体会体育最新地址 中加入抗生素以抑制无质粒细胞(P-)的生长和繁殖；2)利用营养缺陷型细胞作为宿主细胞，构建营养缺陷型互补质粒，设计营养缺陷型华体会体育最新地址 抑制无质粒细胞(P-)的生长和繁殖；3)噬菌体抑制及转化子中自杀蛋白的表达，在含“选择压”的华体会体育最新地址 中华体会体育最新地址 因工程菌可以有效地抑制(P-)细胞的生长和繁殖，提高质粒稳定性。这种方法对于质粒或宿主细胞本身发生了突变，虽保留了选择性标记、但对不能表达目的产物的细胞无效。

5、控制培养条件

5.1 华体会体育最新地址 组成

华体会体育最新地址 组成成分及其比例对质粒的稳定性影响较大。

5.2 氧传递和搅拌

对固定化重组工程菌菌培养来说，氧传递受固定化胶粒屏障和胶粒表面高浓度细胞的限制，搅拌速率影响着培养液内的氧供应和对菌体的剪切力，强烈搅拌使固定化胶粒内细胞浓度明显减少，质粒稳定性也显著降低，温和的搅拌速率适于保存质粒的稳定性。在搅拌罐发酵时，质粒拷贝数通常比摇瓶培养低，原因是搅拌罐中有较好通气，生长速率较高，染色体复制增加，当溶解氧强度在非选择性华体会体育最新地址 中周期变化时，重组酵母连续培养质粒稳定性强烈依赖于培养的生长速率，在较低生长速率下完全稳定，提高氧压力或增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，而过渡或稳定阶段缺氧条件引起氨基酸生产和质粒稳定性受限制。

5.3 温度和pH

有的质粒属温度敏感型质粒，如农杆菌质粒，当农杆菌培养温度超过30℃，即引起质粒丢失。对于温度敏感型质粒，为了控制在生长前期其外源基因不表达，一般采用二阶段温度培养系统，即在菌体生长阶段，采用较低的培养温度，当菌体生长至适宜浓度和生长时期时，提高温度进行诱导，使外源基因表达。与一般微生物发酵相似，重组工程菌的生长和产物合成时的pH值往往不同，如重组Laclococcus lactis subsp.Lactis对生长和质粒稳定性的最适pH值分别为6.39和6.4118。

5.4 选择合适的培养操作方式

5.4.1 适当采用流加操作方式

不同流加方式对质粒的稳定性影响也较大。在研究生产重组葡聚糖酶的枯草杆菌质粒稳定性时发现，周期性分批流加的酶产量和质粒稳定性高于间歇培养和恒化器培养，周期2-4h，质粒稳定；大于6h，质粒丢失增多，而间歇性培养和恒化器培养时质粒很快丢失1。另外，选择合适的流加方式可提高质粒在非选择性华体会体育最新地址 中的稳定性和工程菌的产量

5.4.2 连续培养

连续培养的方式很多，一种选择性循环反应器在连续培养过程中采用诱导方法使含质粒细胞在分离器中絮凝，而细胞生长和产物合成在主发酵罐中进行，循环过程将目的菌株(含质粒菌株)和非目的菌株(不含质粒或杂菌)分开，富集重组菌或生产菌，能使含质粒细胞占优势并能高速合成外源蛋白。连续培养的稀释速率对质粒稳定性有显著影响。

5.4.3 固定化培养

细胞固定化是在固定化酶技术的基础上发展起来的，细胞的固定化方法可以分为吸附法、包埋法、交联法及共价法等。由于大部分细胞在固定化后仍可以保持生长繁殖能力，因此，大多数研究工作都集中在吸附法和包埋法。固定化细胞的主要优点是：细胞可以重复或连续使用，可以提高生产效率；另外，细胞固定化后，可以为细胞创造一个适宜的局部环境(如温度、pH、剪切力等)，有利于细胞的生长和产物表达。对于基因工程菌而言，相对于游离细胞悬浮培养，固定化细胞培养可以有效克服或减少质粒不稳定现象，特别用非选择性华体会体育最新地址 时，固定化细胞培养系统可提高反应器产率，得到高细胞浓度和高产物。在固定化细胞培养体系中，重组质粒稳定性得到提高，但其机理还不是很清楚，主要原因可能有：1)固定化细胞的生长速率下降；2)细胞的区域化分布；3)固定化材料的物理结构和化学性质影响质粒稳定性，使得质粒的分离不稳定性得到改善，不含质粒细胞的生长优势减少，使质粒稳定性高于游离细胞培养6在细胞固定化方法及固定化细胞反应器的研究中，应该注意尽可能地应用最简单的固定化方法及与其相匹配的最优生物反应器。中空纤维反应器、固定床反应器、三相流化床反应器等就是其中的典型例子，这些反应器有些已经工业化应用，有些还处于实验室或工业化实验研究阶段。

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