其反应混合物不仅含有所需的mRNA产物，还含有包括酶（RNA聚合酶、磷酸酶）和模板DNA，以及IVT期间形成的mRNA副产物（主要包括dsRNA和截断的RNA片段）等一些杂质，研究和实验室规模的纯化通常采用DNA酶切加氯化锂(LiCl)沉淀的方法。然而该方法不能去除dsRNA和截短的RNA片段，它们的存在会刺激异常的免疫信号通路，降低目的mRNA翻译效率。大规模生产中，目前首选层析结合切向流过滤的方法。常用于mRNA纯化的层析法包括体积排阻层析、反相离子对层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。

此方法是根据体积大小分离纯化RNA分子，SEC填料具有一定孔径范围，大分子因无法进入孔内而先流出层析柱，小分子后流出。SEC快速液相层析法可应用到制备规模的纯化过程，实现高纯度和高产率。首次发表的大规模RNA的纯化方案中使用了该方法，SEC的局限性在于不能去除分子大小相近的杂质（如dsDNA）。

是利用mRNA上带负电荷寡核糖核苷酸-磷酸主链与流动相中的季铵盐化合物(三乙基醋酸铵)配对，成为亲脂性化合物，可以与反相层析柱的固定相相互作用，用适当的溶剂(如乙腈)进行梯度洗脱，该方法可以有效地去除dsRNA、截短RNA片段和DNA杂质，同时保持工艺的高收率。然而，IPC推广成本高昂，且药物生产中不宜使用乙腈等有毒试剂。

利用目标mRNA和不同杂质之间的等电点不同带来的电荷差异进行mRNA纯化。与IPC相比具有更高的结合能力，其中弱阴离子交换层析法已经成功应用到大规模mRNA纯化过程。IEC可扩展，可用于大规模纯化，成本效益高，可以分离较长的RNA转录本。

利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的mRNA上疏水核苷酸残基发生可逆性结合而进行分离的方法，也是可用于RNA纯化的有效方法。选择合适的结合盐处理后，IVT混合物中DNA和dsRNA将无法结合层析柱而被除去，截短的RNA片段会在完整的ssRNA之前洗脱出来，NaOH用于去除大部分蛋白质类杂质。此方法放大有难度。

是一种压力驱动的，根据分子尺寸差异进行的膜分离过程，其过滤过程中液体流动方向与过滤方向垂直，通过多次再循环的方式，切向通过膜的表面。比膜截留分子量大的目标分子得到了保留，然而小分子和缓冲液通过了膜。IVTmRNA反应体系中除了大分子酶、模板DNA、mRNA副产物等以外，还含有许多小粒径杂质，如游离的NTP、Triton-X-100、帽类似物、氯化镁、Tris缓冲液等。这些小粒径杂质可通过切向流过滤（TFF）在浓缩或渗滤过程得到很好的去除。

层析步骤之后dsRNA被去除，但同时在mRNA溶液中引入的HEPES、EDTA、氯化钠和乙醇，需要进行第二次的切向流过滤（TFF2）步骤去除这些杂质，同时进行缓冲液置换以用于下游的LNP制剂工艺。TFF2选择截留分子量为100kDa的超滤膜，用10倍体积的50mM的醋酸钠进行洗滤。TFF2的截留液包含单链mRNA和醋酸钠。