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注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。

文章导读： 本文详细概括了 CRISPR/Cas 系统 常见的三种应用模式，包括 质粒DNA介导的基因编辑、mRNA介导的基因编辑和Cas蛋白（RNP）介导的基因编辑 。然后汇总了CRISPR /Cas基因编辑三大领头公司（Editas、Intellia和CRISPR）的管线布局和最新临床进展，并对CRISPR/Cas基因编辑疗法的发展前景进行了展望。

主要缩略语：

CRISPR (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)：成簇的、规律间隔的短回文重复序列

Cas蛋白 (CRISPR-associated [Cas] proteins)：CRISPR相关蛋白

RNP (ribonucleoprotein)：核糖核蛋白，通常由特定RNA和蛋白质组成

pDNA (plasmid DNA)：质粒DNA

mRNA (messenger RNA)：信使RNA

sgRNA (single guide RNA)：单向导RNA

一、CRISPR/Cas系统的应用模式

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术崭露头角，改变了传统的基因操作手段。2020年，诺贝尔化学奖授予艾曼纽尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpenticr）和詹妮弗·杜德纳（Jcnnifer A. Doudna），以表彰她们发现基因编辑利器之一CRISPR-Cas9。CRISPR-Cas9的发现简化了原本繁琐复杂的基因编辑工作，推动了基因编辑技术的发展，并在生命科学领域造成革命性的影响。

既往菌菌介绍了CRISPR-Cas9的发展历程和作用机制，感兴趣的可戳链接查看全文：基因剪切工具“变形记”——后浪CRISPR-Cas9成长历程回顾

CRISPR/Cas系统 有三种常见的应用模式，分别由pDNA (质粒DNA)、mRNA (信使RNA)和RNP复合体 (核糖核蛋白复合体，通常由特定RNA和蛋白质组成)介导。 如下图所示，pDNA、mRNA和RNP复合体递送至细胞后，历经不同的胞内过程，在sgRNA (单向导RNA)的导向下，完成靶基因的编辑。由于质粒DNA、mRNA和RNP复合体本质的不同，三者具备不同的胞内过程，三者的生产难度、稳定性、起效时间、编辑效率、脱靶效应和安全性也不尽相同。

图1: CRISPR/Cas系统的三种应用模式

1.1pDNA介导的CRISPR/Cas基因编辑

研究人员发现，可以使用单个或多个质粒编码Cas9蛋白和sgRNA。质粒DNA递送至细胞后，转录形成Cas9 mRNA和sgRNA，随后Cas9 mRNA翻译成Cas9蛋白，与sgRNA形成RNP复合体，完成靶基因的编辑。质粒DNA介导的CRISPR/Cas基因编辑的优势在于质粒DNA易于构建，且生产成本低。

然而，质粒DNA介导的CRISPR/Cas基因编辑存在以下风险：第一，必须选择适合Cas9和sgRNA表达的启动子以保证基因的表达；其次，Cas9蛋白需经转录和翻译途径产生，基因编辑时效会延迟；另一方面，质粒DNA介导的Cas9蛋白表达延长，可能增加脱靶效应和免疫原性，且存在质粒DNA与宿主基因组随机整合的风险。如选择质粒DNA进行基因编辑，应对其风险进行全面评估。

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1.2mRNA介导的CRISPR/Cas基因编辑

有研究人员尝试将Cas9 mRNA和sgRNA共同递送至靶细胞，利用mRNA介导CRISPR/Cas基因编辑。与质粒DNA相比，mRNA在细胞中的转换速度更快，限制了蛋白质的持久性，从而减少了潜在的脱靶效应。

mRNA体外转录、加帽加尾、核苷酸修饰和递送系统的发展，逐步解决了mRNA稳定性、翻译效率、免疫原性等挑战。研究人员通常合成携带5’ Cap和poly(A)尾的Cas9 mRNA，增强mRNA在细胞质内的稳定性，确保有效的mRNA翻译。其次，外源性mRNA可被Toll样受体（TLRs, Toll-like receptors）识别，引发中重度免疫反应，为避免以上免疫原性，可在mRNA合成过程中耗尽尿苷或掺入假尿苷。也有研究表明，对sgRNA进行化学修饰可提高其稳定性、降低免疫原性。Cas9 mRNA与sgRNA均需借助合适的递送系统保护RNA免受降解，并辅助RNA进入靶细胞。

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1.3RNP介导的CRISPR/Cas基因编辑

以CRISPR/Cas9为例，RNP复合体由Cas9蛋白和sgRNA组成，通过将Cas9-gRNA RNP递送到细胞核内发挥基因编辑作用。RNP介导的CRISPR/Cas9基因编辑有以下优势：第一，Cas9-gRNA复合体可递送到多种类型的细胞，包括难以转染的细胞，如免疫细胞和干细胞，这一优势很大程度上决定了Cas9-gRNA RNP的临床治疗潜质。第二，将RNP直接递送至细胞，可以解决某些罕见真核启动子导致的蛋白质表达困难，如许多CRISPR质粒中发现的CMV或EF1A启动子，保证较高的基因编辑效率。第三，RNP的半衰期较短，限制脱靶效应的可能性。最后，Cas9 RNPs转染后很快就能检测到高水平的Cas9 RNPs，随后通过蛋白质降解途径迅速从细胞中清除。

RNP介导的CRIPR/Cas基因编辑同时面临一定的挑战。首先，Cas9蛋白注入血液后易被蛋白酶降解；其次，RNP分子较大，可能限制其穿透细胞膜。可通过选择合适的递送载体解决以上难题。另一方面，生产过程中需保证Cas9蛋白纯度和活性，这是Cas9蛋白发挥基因剪刀作用的必要条件。

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小结：上文介绍了CRISPR/Cas系统常见的三种应用模式，包括质粒DNA介导的基因编辑、mRNA介导的基因编辑和Cas-RNP介导的基因编辑。由于质粒DNA、mRNA和RNP复合体分子本质的不同，经过不同的胞内过程发挥作用，因此三者的设计和生产难度、稳定性、起效时间、编辑效率、脱靶效应和安全性也不尽相同，详见下表。

表1 DNA、mRNA和Cas-RNP基因编辑的比较

二、Editas、Intellia和CRISPR公司的管线及最新进展

Editas、Intellia和CRISPR三家公司均布局了体内（in vivo）和体外（ex vivo）基因编辑。体内基因编辑是将核酸酶或核酸酶编码基因，联合gRNA直接转至人体，在体内实现靶基因的编辑，而体外基因编辑在体外使用DNA、mRNA或Cas蛋白对靶细胞进行编辑，随后输送至患者体内。表2汇总了三家公司已进入临床阶段的管线，以供参考。

表2 Editas、Intellia和CRISPR公司的研发管线-临床阶段

公司		项目编号	应用模式	适应症	研究阶段
Editas	体内	EDIT-101	DNA-AAV	LCA10 莱伯尔先天性黑蒙10型	Phase I/II
Editas	体外	EDIT-301	RNP	SCD, TDT 镰状细胞病, 输血依赖性β地中海贫血症	Phase I/II
Intellia	体内	NTLA-2001	mRNA-LNP	ATTR 转甲状腺素蛋白淀粉样变性	Phase I
	体内	NTLA-2002	mRNA-LNP	遗传性血管性水肿	Phase I/II
	体外	OTQ923 /HIX763	Undisclosed	SCD 镰状细胞病	Phase I/II
	体外	NTLA-5001	mRNA-LNP	AML 急性髓性白血病	Phase I/II
CRISPR	体外	CTX001 /Exa-cel	RNP	SCD, TDT 镰状细胞病, 输血依赖性β地中海贫血	上市申请
		CTX110	Undisclosed	B细胞恶性肿瘤	Phase I/II
		CTX120	Undisclosed	多发性骨髓瘤	Phase I
		CTX130	Undisclosed	肾细胞癌, T或B淋巴细胞	Phase I
		VCTX210	Undisclosed	T1D I型糖尿病	Phase I

2.1 Editas Medicine的管线布局与最新研究进展

Editas Medicine（以下简称Editas）由张锋参与创办，聚焦于两种CRISPR核酸酶Cas9和Cas12a。据网站公开信息，Editas布局了4个体内基因编辑管线，以DNA介导的模式为主，其中进展最快的是EDIT-101，适应症是莱伯尔先天性黑蒙10型（LCA10, Leber Congenital Amaurosis 10），当前处于I/II期临床阶段，已公布积极结果；EDIT-102和EDIT-103仍处于临床前阶段，适应症分别为遗传性耳聋-色素性视网膜炎综合征（USH2A, Usher Syndrome 2A）、视紫红质相关常染色体显性视网膜色素变性（RHO-adRP, Rhodopsin-Associated Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa）。另一项用于眼科疾病的管线仍处于早期发现阶段。EDIT-101、EDIT-102和EDIT-103均以腺相关病毒（AAV, adeno-associated virus）为载体，将Cas9蛋白编码基因和向导RNA编码基因递送至体内。

Editas在体外基因编辑领域开发了EDIT-301，正在开展I/II期临床研究，适应症是镰状细胞病（SCD, Sickle Cell Disease）和输血依赖性β地中海贫血症（TDT, Transfusion-Dependent Beta-Thalassemia）。EDIT-301疗法将Cas12a与gRNA组成的RNP复合体转至细胞内，随后输送到患者体内，已取得积极的初期临床数据。

2.2 Intellia Therapeutics的管线与最新研究进展

Intellia Therapeutics（以下简称Intellia）由诺奖得主Jennifer Doudna创办，目前公布了8个体内基因编辑管线和6个体外基因编辑管线，其中4个管线已进入临床阶段。

体内基因编辑领域进展较快的有NTLA-2001和NTLA-2002，属于mRNA介导的基因编辑，使用脂质纳米颗粒（LNP）包封Cas9 mRNA和sgRNA。NTLA-2001目前处于I期临床阶段，由Intellia和再生元共同开展，适应症是转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR, Transthyretin Amyloidosis）。Intellia和再生元于2021年公布了NTLA-2001的早期临床结果，并发表在顶级医学期刊NEJM（新英格兰杂志）。2022年11月，Intellia公布了NTLA-2002的最新临床进展，其治疗遗传性血管水肿（HAE）I/II期临床试验的中期数据显示了积极的结果。此外，有多项体内编辑疗法仍处于临床前阶段，拟开发适应症涉及血友病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症。

体外基因编辑方面，Intellia和诺华合作研究的OTQ923/HIX763处于I期临床，适应症为镰状细胞病。肿瘤领域的多个基因编辑管线也处于开发阶段。

2.3 CRISPR Therapeutics的管线布局与最新研究进展

CRISPR Therapeutics（以下简称CRISPR）的创始团队包括诺奖得主Emmanuelle Charpentier，CRISPR公司在体外基因编辑领域进展较快，体内基因编辑管线仍处于临床前阶段。

在体外基因编辑方面，CRISPR公司的CTX001（Exa-cel, exagamglogene autotemcel）已发展至上市申请阶段，适应症是镰状细胞病（SCD）和输血依赖性β地中海贫血症（TDT）。据CRISPR公司早期公告，CTX001将于2022年11月向FDA滚动提交上市申请，预计在2023年第一季度末完成提交，有望成为首款上市的CRISPR基因编辑疗法。

其他体外基因编辑管线CTX110、CTX120、CTX130和VCTX210处于I-II期临床阶段，适应症包括B细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌或T/B淋巴细胞癌、I型糖尿病。

展望

文章介绍了CRISPR/Cas系统常见的三种应用模式，包括质粒DNA介导的基因编辑、mRNA介导的基因编辑和Cas-RNP介导的基因编辑。然后汇总了CRISPR /Cas基因编辑三大领头公司（Editas、Intellia和CRISPR）的管线布局和最新临床进展。从管线布局来看，三家公司核心技术不尽相同，Editas公司在体内基因编辑领域专注于以AAV为载体的DNA，在体外基因编辑领域专注于RNP技术，适应症以罕见遗传病为主。CRISPR公司体外基因编辑同样聚焦于RNP，适应症包括罕见遗传病、肿瘤、代谢性疾病。而Intellia公司则以mRNA为核心技术，布局了体内和体外基因编辑技术。

综上所述，CRISPR/Cas系统常见的三种应用模式包括质粒DNA、mRNA和Cas-RNP介导，三种技术各有优劣，不同公司围绕不同的核心技术开展验证性试验。当前基因编辑疗法的长期安全性仍需在长期试验中进行验证，但“一次治疗，终身受益”的特质将会不断吸引企业跻身基因编辑的创新药赛道。

参考文献：

[1] Rouatbi N, McGlynn T, Al-Jamal KT. Pre-clinical non-viral vectors exploited for in vivo CRISPR/Cas9 gene editing: an overview. Biomater Sci. 2022 Jun 28;10(13):3410-3432. doi: 10.1039/d1bm01452h.

[2] Bloomer H, Khirallah J, Li Y, Xu Q. CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated genome and epigenome editing in mammalian cells. Adv Drug Deliv Rev. 2022 Feb;181:114087. doi: 10.1016/j.addr.2021.114087.

[3] Zhang HX, Zhang Y, Yin H. Genome Editing with mRNA Encoding ZFN, TALEN, and Cas9. Mol Ther. 2019 Apr 10;27(4):735-746. doi: 10.1016/j.ymthe.2019.01.014.

[4] Bloomer H, Khirallah J, Li Y, Xu Q. CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated genome and epigenome editing in mammalian cells. Adv Drug Deliv Rev. 2022 Feb;181:114087. doi: 10.1016/j.addr.2021.114087.

[5] Gillmore JD, Gane E, Taubel J, et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med. 2021 Aug 5;385(6):493-502. doi: 10.1056/NEJMoa2107454.

[6] Editas Medicine.https://www.editasmedicine.com

[7] Intellia Therapeutics.https://www.intelliatx.com

[8] CRISPR.https://crisprtx.com/

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