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导读：本文解读了Robin J Shattock^[1]作为通讯作者在Cell & Molecular Biology发表的文章：《Design-of-experimentsin vitro transcription yield optimization of self-amplifying RNA》。本研究通过实验设计（DoE）方法优化了长saRNA（约9.4kb）的IVT过程，以产生最大RNA产量，并验证了不同大小RNA的最佳IVT条件。

主要缩略语

DoE：design of experiment，实验设计；

fLuc：firefly luciferase，萤火虫荧光素酶；

GOI：gene of interest，目的基因；

IVT：in vitro transcription，体外转录；

NTP：nucleoside triphosphate，核苷三磷酸；

pDNA：plasmid DNA，质粒DNA；

saRNA：self-amplifying RNA，自扩增RNA；

VEEV：Venezuelan Equine Encephalitis Virus，委内瑞拉马脑炎病毒。

随着mRNA疫苗在全世界的广泛使用，mRNA疗法展现了强大的能力。近期，一项名为自扩增RNA疫苗（saRNA）新一代mRNA疫苗开始受到关注。saRNA是一种单链RNA，来源于正链病毒基因组，如α病毒。与传统mRNA疫苗相比，新型的saRNA疫苗，可以在体内进行自我扩增，因此只需要极低的剂量，就能通过自我扩增，产生高水平抗原，引起较强的免疫反应。目前的IVT方案主要针对小RNA（<100 nt）进行开发和优化，但不适用于saRNA。因为saRNA更长且具有高度的二级结构，所以IVT的最佳条件可能与mRNA不同。因此，本研究的目标是使用实验设计（DoE）方法来优化IVT，提高长saRNA（约9.4kb）的产率。

一、DoE流程

DoE是一种用于确定已知影响特定过程或过程输出的每个因素或变量之间关系的方法。通过使用这种方法，我们试图建立每个变量之间的数学关系，并确定最有影响的因素，以使最大化输出。

图1 本研究中所有DoE的可视化流程图，以实现IVT的最佳条件

1、首先进行一个完整的两级析因DoE，以确定哪些成分在IVT中具有最高的影响以及它们的次要相互作用；

2、利用全三级析因DoE来探索钠（Na⁺）、镁（Mg²⁺）和NTPs之间的关系，并确定乙酸根离子和氯离子之间的差异，以提高RNA浓度；

3、滴定乙酸镁（MgOAc₂）的浓度，以确定NTPs和Mg²⁺之间的最佳比例；

4、滴定T7 RNA聚合酶的浓度；

5、在IVT期间的不同时间点增加了乙酸钠（NaOAc）浓度，以观察是否能提高RNA产量；

6、最终筛选DoE，以了解加入焦磷酸酶、亚精胺、二甲基亚砜（DMSO）、甜菜碱和Triton X-100或吐温20的重要性。

7、比较了在两个不同时间点添加和不添加焦磷酸酶的最佳条件；

8、用最佳IVT条件制备不同大小的RNA，并在体外转染这些RNA，然后进行流式细胞术以确认蛋白质表达。

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二、DoE实验结果

IVT的影响因素见表1。使用1μg线性化DNA模板，并在所有IVT反应中保持恒定，每个反应的最终体积为100μL，在37°C下孵育2、4或6小时。

表1 IVT的影响因素列表

DoE实验结果发现，镁对RNA产量的影响最大，乙酸根离子比氯根离子更有效地提高RNA的产量。此外，镁和核苷三磷酸盐（NTPs）之间的相互作用对IVT非常重要。在IVT期间进一步添加乙酸钠（NaOAc）对RNA产量的增加无益。此外，焦磷酸酶对IVT生产不是必需的。最佳的IVT方法可用于合成不同长度的RNA。这些发现强调了通过IVT合成高质量和数量的saRNA的能力，并且每种组分的最佳量对于它们的相互作用以产生高RNA产量至关重要。

三、IVT最佳条件

最终优化的IVT条件见表2。

表2 IVT的最佳反应条件

四、IVT最佳条件验证——可用于合成编码不同目的基因的saRNA，在体外具有良好的蛋白质表达

图2 IVT最佳反应条件验证

为了确认IVT最佳条件可用于合成不同大小的RNA，本研究制备了另外四种pDNA模板，用于制备编码不同GOI的saRNA，包括增强型绿色荧光蛋白（eGFP，8.5kb）、多药耐药基因-1（MDR1，11.5kb）和副流感病毒5的多药耐药基因-1（MDR1-PIV5，12.4kb）。此外，本研究还使用编码fLuc的pDNA来合成mRNA fLuc（1.8kb）。每个RNA种类的大小在1.8至12.4 kb之间。结果发现，无论RNA大小如何，优化的IVT条件（表2）产生了高产量的优质RNA（图2A和B）。VEEV-fLuc、VEEV-eGFP、VEEV-MDR1、VEEV-MDR1-PIV5和mRNA fLuc的总产量分别为118、150、142、169和41μg；而VEEV-fLuc、VEEV-eGFP、VEEV-MDR1、VEEV-MDR1-PIV5和mRNA fLuc的平均摩尔数分别为38.94、54.77、38.32、42.48和70.28 pmol。最后，研究者将这些RNA转染HEK293T.17细胞，并在转染后48小时收获细胞，以确认每个GOI中saRNA和fLuc mRNA的蛋白表达。实验观察到每个saRNA和fLuc mRNA都适当表达蛋白质（图2C）。

总结

本研究的目的是利用DoE方法来优化长saRNA的IVT过程，以实现最大的RNA产量。研究发现镁在IVT中起着最重要的作用，尤其是它与NTPs的相互作用，这两种成分的正确平衡是产生高RNA浓度所必需的。此外，与氯离子相比，乙酸根离子对IVT更有效，IVT在MgOAc₂75mM和NTPs每10mM时最有效。通过在IVT过程的不同时间点添加NaOAc来维持离子强度并不能产生高RNA产量。研究还发现，降低T7 RNA聚合酶阻碍了IVT过程，并且IVT不需要焦磷酸酶来产生最大的RNA浓度。最后，我们观察到IVT的优化条件可用于产生1.8-12.4kb的RNA，并且每种类型的RNA都是功能性的，因此一旦转染到细胞中就能够表达蛋白质。

由于许多IVT方案已针对较短的mRNA进行了优化，因此DoE方法的应用被证明对了解每种反应组分之间的相互作用以产生最大产率的长RNA具有指导意义。通过确定IVT期间saRNA共加帽的最佳条件，可以进一步获得益处。然而，本研究优化的IVT反应条件可产生高产量的saRNA，可用于生产大量用于研发目的的saRNA，并有可能扩大到saRNA疫苗和生物治疗药物的GMP生产中。

参考文献

[1] Samnuan K, Blakney AK, McKay PF and Shattock RJ. Design-of-experimentsin vitrotranscription yield optimization of self-amplifying RNA [version 1; peer review: 1 approved with reservations].F1000Research2022,11:333

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